الوقت الفاصل بين التصوير من الخلايا الثديية سابق للورم ظهاري الأولية المستمدة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا لسرطان الثدي
Summary
يتم استخدام الوقت الفاصل بين التصوير لتقييم سلوك الخلايا الظهارية الثديية سابق للورم الأولية المستمدة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا من خطر الاصابة بسرطان الثدي لتحديد ما إذا كانت هناك علاقة بين المعايير السلوكية والآفات الجينية المحددة متميزة.
Abstract
ويمكن استخدام الوقت الفاصل بين التصوير لمقارنة سلوك الخلايا الثديية الأولية مثقف سابق للورم الظهارة المستمدة من نماذج مختلفة الماوس المعدلة وراثيا للإصابة بسرطان الثدي. على سبيل المثال، يمكن أن يكون كميا الوقت بين انقسامات الخلية (أعمار الخلية)، وأرقام الخلية أفكارك، وتطور التغيرات المورفولوجية، وآلية تشكيل مستعمرة ومقارنة في خلايا تحمل آفات جينية محددة. وتولد انتخابات الثديية الثقافات من الخلايا الظهارية ورم الغدد الثديية دون اضح. ومقطوعة بعناية الغدد مع فصل واضح من العضلات المجاورة، تتم إزالة الغدد الليمفاوية، ويتم إنشاؤها وحيدة الخلية تعليق من الخلايا الظهارية الثديية المخصب من الأنسجة الثديية تنميق تليها التفكك الأنزيمية والترشيح. ومطلي وحيدة الخلية المعلقات وضعها مباشرة تحت المجهر داخل غرفة حاضنة للخلايا الحية التصوير. ستة عشر 650 ميكرومتر ميكرومتر X حقول 700 في تكوين 4X4 من كل ثوالتقط الذراع من لوحة 6 جيدا كل 15 دقيقة لمدة 5 أيام. يتم فحص الوقت الفاصل بين الصور مباشرة لقياس السلوكيات الخلوية التي يمكن أن تشمل آلية وتواتر تشكيل خلية داخل مستعمرة على مدار 24 ساعة الأولى من الطلاء الخلايا (التجميع مقابل تكاثر الخلايا)، حدوث موت الخلايا المبرمج، والتخلص من تغيرات شكلية. يتم استخدام وحيدة الخلية تتبع لتوليد خرائط مصير الخلية لقياس أعمار الخلايا الفردية والتحقيق في أنماط انقسام الخلايا. ويتم تحليل البيانات الكمية إحصائية لتقييم للفروق ذات دلالة إحصائية في السلوك يرتبط الآفات الجينية المحددة.
Introduction
نماذج الماوس المعدلة وراثيا هي أدوات لدراسة وفهم كيفية آفات جينية مختلفة تسهم في خطر الاصابة بسرطان الثدي. على سبيل المثال، أظهرت الفئران المعدلة وراثيا أن الجمع بين ثلاثة عوامل هي: فقدان الثدي كامل طول السرطان 1، بداية مبكرة (BRCA1) الجينات في الخلايا الظهارية الثديية، ورم P53 البروتين (TP53) الجرثومية الخط haploinsufficiency، والثدي الظهارية خلية مستهدفة حتى التنظيم ألفا الاستروجين مستقبلات النتائج التعبير (ERA) في تطوير سرطان الثدي في 100٪ من floxed BRCA1) و (فيروس الورم 11/f11/Mouse الثديية (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( تيت-OP) -ER/MMTV-reverse التتراسيكلين transactivator (الفئران rtTA من 12 شهرا من العمر بالمقارنة مع انخفاض النسب المئوية الواردة في BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / – الفئران دون الإفراط في عصر التعبير (~ 50 – 60٪) وBRCA1 الفئران f11/f11/MMTV-Cre دون haploinsuf TP53ficiency (<5٪) 1
ديناميكية الوقت الفاصل بين التصوير من سلوك الخلايا الثديية سابق للورم الظهارة الأولية تكشف الاختلافات في سلوك الخلية التي هي أقل تقدير بسهولة في الأنسجة أقسام ثابتة. ويلاحظ تغييرات في الانتشار والتمايز في الخلايا الثديية الابتدائية من حاملات التحور BRCA1 الإنسان. يتم إنشاؤها من 2: إنشاء وحيدة الخلية تعليق من الخلايا الظهارية الثديية الأولية من العادي والفئران المهندسة وراثيا من خلال تفارق الأنزيمية من الأنسجة مقطوعة الغدة الثديية. 3 الوقت الفاصل بين وينظر إلى الصور لتقييم آلية وتوقيت ظهور مستعمرة الخلايا وحدوث تغيرات شكلية في الخلايا الظهارية، بما في ذلك الانتقال الوسيطة (EMT) وموت الخلايا المبرمج. جيل من الخرائط مصير الخلية، وتيسير الكمي لطول الفترة الزمنية بين انقسامات الخلية (أعمار الخلية)، وتحديد أنماط انقسام الخلايا عن طريق استخدام وحيدة الخلية تتبع. تيمأداة لتتبع (TTT) هو البرمجيات المتاحة للعموم استخدامها لتوليد خرائط مصير وحيدة الخلية. وقد أنشئت فائدته في توضيح آليات مصير الخلية خلية عادية 4،5 دراسة الجذعية المكونة للدم التنمية 6-9 و توليد الخلايا العصبية 10
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الحاسمة
من المهم للتأكد من أن يتم حصاد الغدد الثديية من الفئران من نفس العمر للتحكم عن التقلبات المرتبطة بالعمر في الخلايا الظهارية الثديية السلوك. عندما الخلايا تصفيح، ينبغي مطلي نفس العدد من الخلايا في كل بئر لكل تجربة. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أود أن أشكر BOFAN وو وRaithel المسيحية للمساعدة التقنية وريجر مايكل على عرضه لخلية الحية التصوير. بدعم من NCI، NIH RO1CA112176 (PAF)، NCI، NIH. R01CA89041-10S1 (PAF)، الألمانية Akademischer Austaush DIENST فولت A/09/72227 المرجع. 316 (REN)، وزارة الدفاع W81XWH-11-1-0074 (REN)، WCU (الدرجة العالم جامعة) البرنامج من خلال مؤسسة البحوث الوطنية لكوريا بتمويل من وزارة التربية والتعليم والعلوم والتكنولوجيا (R31-10069) (PAF )، NIH IG20 RR025828-01 (مرفق معدات القوارض الجدار)، والمعاهد الوطنية للصحة NCI 5P30CA051008 (الميكروسكوب والتصوير والثروة الحيوانية المشتركة).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| EpiCult-B Basal Medium Mouse | StemCell Technologies | 05610 | |
| EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse | StemCell Technologies | 05612 | |
| recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF) | StemCell Technologies | 02633 | |
| Collagenase/Hyaluronidase | StemCell Technologies | 07912 | |
| Disposable Scapels | Feather | 2975#10 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | StemCell Technologies | 37150 | |
| Ammonium Chloride | StemCell Technologies | 07800 | |
| Tryspin-EDTA | StemCell Technologies | 07901 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 07913 | |
| DNase I | StemCell Technologies | 07900 | |
| 40 μm cell strainer | StemCell Technologies | 27305 | |
| FBS | StemCell Technologies | 06100 | |
| PenStrep | Gibco | 15140 |
References
- Jones, L. P., et al. Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer. Oncogene. 27, 794-802 (2008).
- Burga, L. N., et al. Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers. Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).
- Li, M., Wagner, K., Furth, P. A., Ip, M., Asch, B. Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer. , (2000).
- Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453, 345-351 (2008).
- Schroeder, T. Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells. Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).
- Eilken, H. M., Nishikawa, S. -. I., Schroeder, T. Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium. Nature. 457, 896-900 (2009).
- Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level. Current opinion in hematology. , (2012).
- Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice. Science. 325, 217-218 (2009).
- Rieger, M. A., Schroeder, T. Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines. Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).
