乳がんの遺伝子改変マウスモデル由来の初代前癌乳腺上皮細胞のタイムラプスイメージング
Summary
タイムラプスイメージングは、特定の行動のパラメータと異なる遺伝的病変の間に相関があるかどうかを判断するために乳癌リスクの遺伝子改変モデルマウス由来の初代前腫瘍性乳腺上皮細胞の挙動を評価するために使用される。
Abstract
タイムラプスイメージングは、乳がんのさまざまな遺伝子改変マウスモデル由来初代培養前腫瘍性乳腺上皮細胞の挙動を比較するために使用できます。例えば、細胞分裂（細胞寿命）、アポトーシス細胞数、形態学的変化の進化、およびコロニー形成のメカニズムの間の時間を定量することができるし、特定の遺伝子損傷を持つ細胞で比較。プライマリ乳腺上皮細胞培養物は、触知可能な腫瘍なし乳腺から生成されます。腺が慎重に周囲の筋肉から明確に分離することで切除され、リンパ節を除去し、濃縮された乳腺上皮細胞の単一細胞懸濁液は、酵素的解離と濾過に続いミンチ乳腺組織によって生成されます。単細胞懸濁液は、ライブセルイメージングのためのインキュベーターチャンバー内に播種し、顕微鏡下に直接配置されます。各ワットから4×4の構成で16 650ミクロン×700μmのフィールド6ウェルプレートのエルは、5日間の15分ごとに結像される。タイムラプス画像は、直接最初の24セルのめっき時間（集計対細胞増殖）、アポトーシスの発生率、および形態学的変化の位相の中で細胞コロニー形成のメカニズムと周波数を含めることができます携帯電話の行動を測定するために検査されます。単一セルのトラッキングは、個々の細胞の寿命と細胞分裂パターンの調査の測定のための細胞運命のマップを生成するために使用されます。定量的なデータは統計的に特定の遺伝子損傷と相関行動の大きな違いを評価するために分析される。
Introduction
遺伝子改変マウスモデルは、異なる遺伝的病変は、乳がんの発症リスクに寄与する方法を勉強し、理解するためのツールです。例えば、遺伝子組み換えマウスは3つの要因の組み合わせが示されている：完全長乳がん1、乳腺上皮細胞における早期発症（BRCA1）遺伝子、腫瘍タンパク質p53（TP53）生殖系列ハプロ不全、および乳腺上皮の損失をセル（f）は11/f11/Mouse乳腺腫瘍ウイルス（MMTV）-Cre/p53 + / -/tetracycline-operator（BRCA1フロックス化の100％で乳腺癌の開発においてアップレギュレートエストロゲン受容体α（ERA）式の結果を標的TET-op）が-ER/MMTV-reverseテトラサイクリントランスアクチベーター（BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53で報告された低い割合と比較して、生後12ヶ月rtTAマウスが+ – / – （〜50過剰発現時代を持たないマウスTP53 haploinsufなし60％）、BRCA1 f11/f11/MMTV-CreマウスFICIENCY（<5％）。1
前癌一次乳腺上皮細胞の挙動の動的タイムラプスイメージングが少なく簡単に静的な組織切片で高く評価されている細胞の挙動の違いを明らかにする。増殖と分化の変化はヒトBRCA1変異保因者からの主な乳腺細胞で観察されています。正常及び遺伝子改変マウスからプライマリ乳腺上皮細胞の単一細胞懸濁液の2作成は切除乳腺組織の酵素的解離によって生成されます。3タイムラプス画像は、細胞コロニーの外観と上皮間葉移行（EMT）とアポトーシスを含む細胞の形態学的変化の発生のメカニズムとタイミングを評価するために見ている。細胞の運命マップの生成が、細胞分裂（細胞寿命）と、細胞分裂のパターンの決定の間の時間の長さの定量化は、単一セルの追跡の使用によって促進されています。ティムのトラッキングツール（TTT）は、単一セルの運命マップを生成するために使用される公に利用可能にするソフトウェアです。細胞の運命決定のメカニズムの解明にその有用性は、通常の造血幹細胞の発達6-9およびニューロンの生成を調べる4,5確立されています10
Protocol
Representative Results
Discussion
重要なステップ
それは乳腺が乳腺上皮細胞の挙動の加齢変動を制御するために、同じ年齢のマウスから採取されていることを確認することが重要です。細胞をプレーティングするときに、同じセルの数は、すべての実験のために、各ウェルに播種しなければならない。文化はそれが可能な連続画像を使用して複数のセルを個別にフォローすることが早すぎるコンフルエント…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、生細胞イメージングへの彼の導入のための技術支援とマイケルリーガーためBofanウーとキリスト教Raithelに感謝したいと思います。 NCI、NIH RO1CA112176（PAF）は、NCI、NIHによってサポートされています。 R01CA89041-10S1（PAF）、ドイAkademischer Austaush DienstのeVのA/09/72227のRef。 316（REN）、国防総省W81XWH-11-1から0074（REN）、教育科学技術省（R31-10069）によって資金を供給され、韓国の国立研究財団を通じてWCU（ワールドクラスの大学）プログラム（PAF ）、NIH IG20 RR025828-01（げっ歯類のバリア設備機器）、およびNIH NCI 5P30CA051008（顕微鏡およびイメージング·アニマル共有リソース）。
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| EpiCult-B Basal Medium Mouse | StemCell Technologies | 05610 | |
| EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse | StemCell Technologies | 05612 | |
| recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF) | StemCell Technologies | 02633 | |
| Collagenase/Hyaluronidase | StemCell Technologies | 07912 | |
| Disposable Scapels | Feather | 2975#10 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | StemCell Technologies | 37150 | |
| Ammonium Chloride | StemCell Technologies | 07800 | |
| Tryspin-EDTA | StemCell Technologies | 07901 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 07913 | |
| DNase I | StemCell Technologies | 07900 | |
| 40 μm cell strainer | StemCell Technologies | 27305 | |
| FBS | StemCell Technologies | 06100 | |
| PenStrep | Gibco | 15140 |
References
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