Summary
Инфракрасный нерва была предложена в качестве альтернативы электрической стимуляции в диапазоне нервных типов, включая те, которые связаны с слуховой системы. Этот протокол описывает метод патч зажим для изучения механизма инфракрасного стимуляция нервов в культуре первичных слуховых нейронов.
Abstract
Это было продемонстрировано в последние годы, что импульсный лазер инфракрасного света может быть использован, чтобы вызвать электрические реакции в нервной ткани, независимо от каких-либо дальнейших изменений ткани-мишени. Инфракрасное нейронных стимуляции сообщалось в различных периферийных и сенсорной нервной ткани в живом организме, с особый интерес показано на стимуляцию нейронов слухового нерва. Тем не менее, в то время как INS было показано, что работать в таких условиях, механизм (или механизмы), в котором инфракрасное излучение вызывает нервного возбуждения в настоящее время не очень хорошо понял. Протокол, представленные здесь описывается целой клетки патч зажим метод предназначен для облегчения Исследование инфракрасных нервного возбуждения в культуре первичных слуховых нейронов. Тщательно характеризующие реакцию этих клеток инфракрасного лазерного освещения в пробирке при контролируемых условиях, то можно получить более глубокое понимание фундаментальных Physicaл и биохимических процессов, лежащих в основе инфракрасного нервного возбуждения.
Introduction
Области нейрофизиологии и медицинские бионика во многом полагаются на методы, которые позволяют управляемым стимуляции электрические реакции в нервной ткани. В то время как электрическая стимуляция остается золотым стандартом в нервном возбуждении, он страдает от ряда недостатков, таких как наличие артефактов стимуляции при записи нервные реакции, а также отсутствие стимуляции специфику в связи с распространением тока в окружающие ткани 1.
Последние два десятилетия мы стали свидетелями развития оптически опосредованной стимуляции методы 2. Некоторые из этих методов требует модификации ткани-мишени, либо путем добавления конкретной молекулы (например, клетку молекулы) 3 или некоторую форму генетической манипуляции (например Optogenetics) 4, ни один из которых просты в применении за пределами исследование параметра. Особый интерес поэтому инфракрасный нервного возбуждения (INS), где Ву нервной ткани возбуждается импульсного инфракрасного лазерного излучения. INS имеет потенциал, чтобы преодолеть многие недостатки электрической стимуляции, позволяя весьма специфический, бесконтактные стимуляции нервной ткани 2. Тем не менее, в то время как INS было успешно продемонстрировано в различных условиях, в естественных условиях, точный механизм возбуждения остается неопределенной.
Согласно последним публикациям показали прогресс в раскрытии механизмов, ответственных за INS 5-7. Быстрый нагрев за счет поглощения лазерного излучения водой видимому, играет ключевую роль. Однако, помимо этого консенсуса пока не достигнуто. Шапиро и др.. 7 предлагает весьма общей механизм, посредством быстрого нагрева вызывает возмущение в распределении заряженных частиц, прилегающей к мембране клетки, что приводит к изменению емкости клеточной мембраны и последующей деполяризации. Кроме того, Альберт и др.. 5 утверждают, что Laseт индуцированного нагрева активирует специфический класс чувствительных к температуре ионных каналов (переходный рецепторный потенциал ваниллоидные канала), что ионы проходить через клеточную мембрану. На данном этапе неясно, как эти механизмы сочетаются, да и вообще, есть ли дальнейшие факторы, которые еще не были идентифицированы.
Несмотря на небольшое число публикаций (ссылки 5,7-9) исследовали INS в пробирке, подавляющее большинство работ в этой области опубликовано была проведена в естественных условиях (например, ссылки 1,6,10-18). Инфракрасный стимуляции слуховых нейронов был области, представляющие особый интерес, в связи с потенциальных применений в кохлеарных имплантах 10,14-18. В то время как в естественных условиях эксперименты важно проверить эффективность метода в различных условиях, повышение уровня Контроль, обеспечиваемый в лабораторных исследованиях как ожидается, приведет к более детальному пониманию мехамом ответственность за INS. Данный отчет описывает получение культивируемых нейронов спирального ганглия для исследований патч зажим, так как они могут быть использованы для изучения фундаментальных механизмов а также ссылки на большое количество существующих данных из слуховой системы.
Техника патч зажим является отличным инструментом для исследования электрофизиологических явлений, обеспечивая средства регистрации электрической активности отдельных клеток и изучение вклада отдельных глубинные течения 19. Когда эта методика применяется к стабильной в пробирке подготовка первичных нейронов, таких как культивируемых нейронов спирального ганглия, он предлагает возможность для углубленного изучения механизмов, посредством которых нервная деятельность находится под контролем и манипулировать.
Протоколам, определенным в этой работе методы план исследования влияния лазерной стимуляции на электрические свойства нейронов спирального ганглия через зажим патчзаписей. Этот подход основан на волокном лазерный а не в свободном пространстве лазер, что позволяет безопасно операции, а также легче и более воспроизводимые выравнивание без необходимости модифицировать стандартную конфигурацию микроскопа. На основании этих протоколов, должна быть возможность проводить широкий спектр экспериментов для того, чтобы более четко определить механизм или механизмы, лежащие в INS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура нейронов спирального ганглия
- Стерилизовать маленькие круглые (например, 10 мм в диаметре) покровные стекла и изогнутые щипцы в автоклаве. Передача стерилизовать покровные в отдельные лунки стерильного 4-кольцо 35 мм чашки Петри или 4-луночного планшета с использованием стерилизованного щипцов. Применить 150 мкл поли-L-орнитин (500 мкг / мл) и мышиного ламинина (0,01 мг / мл) к верхней поверхности покровного стекла и место в инкубаторе (37 ° С) в течение 48 часов. Убедитесь, что покровные не плавают от дна скважины.
- Подготовка 50 мл стерильной нейробазальной среды (NBM) для каждого нейронные культуры: 47,5 мл нейробазальной, 0,5 мл N 2 добавки, 1 мл B27 добавки, 0,5 мл L-глутамина и 0,5 мл пенициллина-стрептомицина. Примечание: Добавки могут быть заморожены, хранили при -20 ° C и добавляли к медиа в день требуется.
- Диссоциируют нейронов спирального ганглия от послеродовой день 4-7 крысят, как описано выше 20,21, намING как ферментативная (0,025% трипсина и 0,001% ДНКаза I) и механического оборудования. См. Whitlon соавт. Виейра 22 и др. 23. Для получения подробных сведений из нейронов спирального ганглия культуры или Паркер и др.. 24 для демонстрации Modiolus изоляции.
- Аспирируйте любой оставшийся раствор poly-L-ornithine/laminin от покровных и мыть кратко в НБМ.
- Добавить 150-200 мкл диссоциированных нейронов ганглиев подвески спирали к покровные и поместить в инкубатор (37 ° C, 10% CO 2). Примечание: до 20 Покровные стекла могут быть получены из средней помет 8 щенков крысы.
- Через четыре часа после покрытия нейронов, аспирации раствором для удаления остатков клеток и заменить 150-200 мкл нагретый свежий НБМ. Примечание: средства массовой информации может потребоваться ежедневное пополнение, чтобы избежать обезвоживания.
- Возврат покровные в инкубатор, пока не потребуется для электрофизиологических записей. Примечание: диссоциированными спиральныекультурах нейронов ганглиев может использоваться для электрофизиологических экспериментов четыре часа после диссоциации и в течение двух дней после этого. Время в пробирке должны быть приняты во внимание в ходе анализа результатов. Пополните НБМ каждые 24-48 часа.
2. Подготовка к записи патч зажим
- Готовят растворы
- Внутриклеточной (микропипетки) Решение: 115 мм K-глюконат, 7 мм KCl, 10 мМ HEPES, 0,05 мМ EGTA, 2 мМ Na 2 АТФ, 2 мМ Mg-АТФ, 0,5 мМ Na 2 GTP (доведения рН до 7,3 с помощью КОН; приспособиться к 295 мосмоль / кг сахарозы). Передайте раствора через стерильный фильтр (0,2 мкм) и разделить на 200 мкл аликвоты не сохраняется при температуре -20 ° C до дня записи.
- Внеклеточный (ванна) раствор: 137 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl 2, 1 мМ MgCl 2, 10 мМ HEPES, 10 мМ глюкозы (доведения рН до 7,4 с помощью NaOH; приспосабливаться к 300-310 мосмоль / кг сахарозы) . Это решение состоит в день записи.
- Подготовьте записи микропипетки с сопротивлением 2-6 МОм. Мы используем СО 2-лазера съемника (P-2000; Саттер инструменты) и боросиликатного стекла (1,0 мм наружный диаметр; 0,58 мм внутренний диаметр, 75 мм длина).
- Подготовьте лазера. Этот протокол предназначен для использования с волокном лазерный, например, 1870 нм Инфракрасный Стимулятор нерва от OptoTech P / L. Оптическое волокно используется для подачи света в наших экспериментах 200/220 мкм ядро / оболочка диаметром кварцевого волокна с числовой апертурой 0,22 и FC-PC разъемов на обоих концах (AFW Технологии MM1-FC2-200/220-5-C -0,22). Патч-корды были сокращены в два раза для получения двух волокна косички (т.е. коннектором на одном конце и расщепляется в другой). Эффекты диаметр сердцевины волокна и числовой апертурой на изменения температуры лазерной индуцированной были подробно рассмотрены Томпсон и др.. 25
- Раскол кончик свет волокно доставки с использованием стандартных методови убедиться, что полученный совет высокого качества от наблюдения с помощью оптического микроскопа (т.е. кончик должна быть перпендикулярна к оси волокна и появляются плоские при визуальном осмотре). Подключите светло-волокна доставки к волоконно-связанной выходе лазерной стимуляции с использованием соответствующей через разъем (например Thorlabs ADAFC2).
- Измерьте выходной мощности лазера от расщепленный кончик волокна света доставки с использованием соответствующего документа (например, когерентное FieldMate с LM-3 головки детектора). Рекомендуется проверить мощность лазера каждый раз, когда свет волокна доставки расщепляется или значительную регулировка производится с лазером (например, перевозки из одной лаборатории в другую).
- Вставьте световод доставки в патроне волокна или аналогичное устройство и прикрепите патрон в соответствующие микроподвижки. Важно иметь возможность точно определить угол θ, что оптическое волокно образует с покровным. Это англе может быть измерено с фотографией экспериментальной установки и использования программного обеспечения для обработки изображений (например ImageJ), чтобы получить угол. Угол θ (или диапазон возможных углов) в основном ограничивается пространственным ограничений экспериментальной установки, - в частности микроскопом. Типичные значения θ в наших экспериментах (на основе прямого микроскопа) около 36 °, однако оптимальным углом могут существенно отличаться для альтернативных установок (например, те, которые используют инвертированный микроскоп).
- Выполняйте соединения между лазером и патч зажим системы сбора данных (например, Digidata 1440A, Molecular Devices), как показано на рисунке 2. Цифровой выход из патч зажим системы сбора данных должен быть подключен к лазерному через внешний генератор функций, что делает возможным определение параметров лазерного импульса независимо от системы сбора данных. Другой стороны, этот выход может быть подключен непосредственно клазерный привод (требуется длительность импульса и частоты повторения быть установлены с помощью программного обеспечения для получения данных). В любом случае сигнал используется для запуска лазер должен быть подключен к входу системы сбора данных, чтобы гарантировать, что сроки и продолжительность лазерных импульсов могут быть записаны одновременно с электрофизиологических сигналов.
3. Патч зажим Записи по расследованию INS
- Заполните соответствующий контейнер перфузии система с внеклеточным раствором и регулировать расход обеспечить перфузию ванну со скоростью 1-2 мл / мин. Мы используем самотечные системы (аспиратор бутылки, запорный клапан, а PE трубки) с встроенным в линию нагреватель для быстрого нагревания раствора, и перистальтический насос для удаления отработанного раствора путем отсасывания.
- Поместите покровное с культивируемых клеток в записи камеры (ванна) из прямой микроскоп. Использование больших увеличениях воды погружения цели (Е. Г. 40X) и фазово-контрастная (например, дифференциального интерференционного контраста или Dodt отличие градиент), визуально определить спиральный ганглий нейронов в культуре. Типичный нейрон спирального ганглия по фазе яркие, круглые и примерно 15 мкм в диаметре с видным ядра, как показано на рисунке 1а.
- После того, как нейрон был расположен, переключиться на более низком увеличении цели (например, 10X) и найдите целевой нейронов в поле зрения.
- Переместить подачи света оптического волокна в положении с использованием следующей процедуры (или эквивалент):
- Использование микроподвижки для перемещения выходного волокна, пока наконечник близка к целевой нейронов как в горизонтальной и вертикальной плоскостях. Вертикальное положение торца волокна может быть проверена путем перемещения объектива вверх и вниз (сканирование фокуса).
- Вернитесь к высокой цели увеличения и позиционирования зонда оптического волокна по своему прямому позицию рядом с TОн нейрона (см. Рисунок 2 вставки). При регулировке вертикального положения волокна, важно, чтобы нижний край волокон лежит на (т.е. только прикосновения) покровное, чтобы свести к минимуму неопределенность в расположении волокон. Оптимальное выравнивание в горизонтальной плоскости, будет зависеть от угла θ, что волокна делает с покровным и радиус волокна р. Для того, чтобы расположить волокна таким образом, что центр мишени нейрона лежит вдоль оси волокна, горизонтальное расстояние между верхним краем волокна и клетки-мишени должны быть
Δ целевых = R (COSEC θ - θ 2 греха),
где отрицательное значение будет указывать, что оптическое волокно выступы клетки. При выравнивании волокно, расстояние Δ целевого между верхним краем волокна и центром нейрона может быть приближенно достигнуто путем визуального осмотра. Однако Δ целевой предназначен дляслужить в качестве приблизительного ориентира только. Позиционирование волокна таким образом, что фактическое расстояние Δ между верхним краем волокна и центром нейрона заметно отличается от Δ цели (как на фиг.1), может дать представление о влиянии как радиальное смещение (т.е. от центра луч) и осевое смещение (т.е. вдоль оси волокна) пучка относительно мишени нейрона. Например, установка Δ ≈ 0 можно было бы ожидать увеличение местной температуры в непосредственной близости от клетки - т.е. с профилем пучка для типичных многомодовых волокон хорошо аппроксимируется верхней распределение шапка 26, снижение локально поглощенной энергии (температуры) из-за смещения от центра луча минимальна по сравнению с увеличением поглощенной энергии от движущихся лица конец волокна ближе к клетке.
В то время как следует позаботиться, чтобы расположить волокна, как точно и как По повторяемостьюssible использованием визуальных ориентиров, точное измерение расположения волокон относительно целевого нейрона (например, Δ) имеет большее значение, чем позиционирование его на заданном расстоянии от отеля. Δ может быть определена (по оценкам неопределенности максимум ± 3 мкм) путем анализа изображений, как описано в пункте 3.8.2 протокола. В некоторых экспериментах 5,8, источников белого света были связаны через волокна с целью выявить нужную ячейку. Этот подход был оказались неэффективными в вертикальном настройки микроскопа, а интенсивность света, рассеянного от целевой области была относительно низкой в этих мелких углов (θ). - Когда волокно находится в положении, переместить его по известным количеством чтобы просто позиционирование микропипетки. Волокно может быть возвращен в исходное положение, когда нейронной записи достигнута.
- Заполните микропипетки с внутриклеточными решение и надежно свои места на головыTage из усилителя (например Multiclamp 700B, Molecular Devices). Использование трубки прикреплены к боковым микроэлектрода держатель, применяют небольшое количество положительное давление, чтобы предотвратить засорение микропипетки.
- Использование микроманипулятор, переместите микропипетки в положение чуть выше целевого нейрона.
- Протокол для записи всего ячейки:
- Нанесите 10 мс, +10 мВ Меандр (например, испытание на герметичность) в фиксации потенциала режима усилителя и отрегулируйте микропипетка потенциал (пипетки зачете) базовый сигнал 0 нА. Печать тест должен также использоваться, чтобы определить сопротивление микроэлектрода находится в пределах желаемого диапазона (например, 2 - 6 МОм).
- Во время контроля сопротивления, использование точных регулировок микроманипулятор осторожно расположить пипетки на поверхность мишени нейрона. Когда микропипетки находится в контакте с нейрона, сопротивление будет увеличиваться (от ~ 0,5 до 1 МОм). Яmmediately после увеличения сопротивления, удалите избыточное давление жидкости и нанесите небольшое отрицательное давление. После сопротивления прошла 10 - 20 МОм, исправить мембранный потенциал к холдингу уровне (например, около -60 мВ).
- Сопротивление электрода должна продолжать увеличиваться, пока не превышает 1 ГОм, показывая, что эффективное уплотнение (называется 'gigaseal') была образована между клеточной мембраной и микропипетки. На данный момент, удалить все давление жидкости из пипетки.
- После gigaseal была сформирована, использовать короткие импульсы тока (от 25 до 100 мкс; +1 V) или короткие импульсы отрицательного давления жидкости для разрыва клеточных мембран и достичь всю конфигурацию ячейки.
- Запишите мембранные емкости, последовательное сопротивление и входное сопротивление, определенная по экспоненциальной кривой установлены на текущее время импульса тест печать. Свернуть переходные емкости, регулируя CpFast и CpSlow управления на усилителе, то Switcч усилителя в режиме цельной клетке, и компенсировать емкость и сопротивление до плоской текущего наблюдается в печать тест. Применить серии компенсация сопротивления (~ 70% коррекции, 70% прогноз), регулируя емкость и сопротивление контроля для поддержания плоской характеристикой печать тест.
- Переключить на текущий зажим в режиме усилителя. Обратите внимание на мембранный потенциал покоя (при отсутствии ввода тока). Установка удерживающего тока для стабилизации мембранного потенциала на заданном уровне (например, -60 мВ). Нейтрализовать пипетку емкостью и регулировать баланс моста, чтобы сбалансировать падение напряжения.
- Проверьте стрельбы свойств нейронов, стимулируя с деполяризующими тока (+10 до +200 Па +10 шагов годовых; 300 мсек).
- Переместить назад оптические волокна в позиции рядом с нейроном. Используя программу обработки изображений, соединенный с ПЗС-камерой, захват изображений из положения волокна по отношению к целевой нейрон, сосредоточив внимание на плоскость нейрона на начальном этапе, а затем по верхнему краю оптического волокна (см. рисунок 1).
- В последующем анализе полученных изображений (например, 1b и 1с Цифры) можно точно определить Δ (положение верхнего края оптического волокна к относительной центр мишени нейрона). После Δ известно, такие параметры, как расстояние от торца волокна к целевой нейрона (вдоль оси волокна) г и радиальное смещение нейрона от центра т δ луч может быть рассчитана с помощью простых тригонометрических соотношений:
Z = R греха 2θ + Δ COS θ
δ R = ((R COS 2θ - грех θ Δ) 2 + Ау 2) 1/2,
где Ау является расстоянием между осью волокна и центром нейрона, если смотреть сверху (например, таковыеэлектронной рис. 1).
Анализ должен учитывать отклонение положения от клетки к клетке, а точное знание этих параметров местоположения может потребоваться для устранения возможных различий между стимуляцией процессов 25.
4. Эксперименты INS
- Во время записи электрофизиологических данных в любом токовых клещей или напряжения зажим конфигурации, запустите стимуляции лазером на нужные параметры (например, мощность, длительность импульса, частота и т.д.). С нашей лазер, оптическая мощность регулируется с помощью прямого ввода в лазерный привод и указывается вручную перед каждой записью. Длительность импульса и частоты повторения может управляться либо внешний генератор сигнала или программное обеспечение сбора данных (как описано в пункте 2.3.4). Убедитесь, что данные записываются с обеих канал патч зажим и лазерный канал курок.
Лазерных импульсов с длинамиот около 500 мкс до 15 мс и энергией ~ 0,25-5 мДж обычно дает измеряемый электрический ответов. Установка частоты повторения лазерных импульсов равной 1 Гц или менее может быть полезно для начальных экспериментов, так как это сводит к минимуму воздействие этого параметра. Типичные результаты, показывающие изменение записанного сигнала представлены в следующем разделе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Спиральные нейронов ганглиев реагировать на лазерного излучения с повторяемых сигналов в обоих фиксации потенциала и тока зажим конфигурации записи. 3а показаны типичные изменения тока через клеточную мембрану в ответ на 2,5 мсек, 0,8 мДж лазерного импульса (средний отклик от 6 лазерных импульсов, повторяющиеся с интервалом в 1 сек) с мембранного потенциала состоялось при -70 мВ, -60 мВ и -50 мВ. Чистые внутренние токи постоянно вызывали в ответ на лазерных импульсов, возвращаясь к начальным значениям после освещения прекратилась. Формы лазерного индуцированных токов можно увидеть, изменяется как мембранный потенциал изменяется, указывая, что это может быть важно для проведения экспериментов в диапазоне проведения потенциала для того, чтобы получить полное понимание процессов, лежащих INS. Эти эксперименты можно проводить с незначительной модификации текущего протокола и проанализированы с использованием установленных методов, таких как заряд напряжения (QV) анализ (себеэлектронной Ссылка 7 примеры кривых QV получены из INS в пробирке).
Данные, представленные на рисунке 3b указывают на изменение мембранного потенциала обычно вызвана 2,5 мс, 0,8 МДж лазерного импульса (начальный мембранный потенциал-73mV, усредненные по 16 лазерных импульсов, подаваемых с частотой повторения 4 Гц). Текущий зажим записи свидетельствуют о неуклонном деполяризации мембраны в течение лазерного импульса последующим примерно к экспоненциальному уменьшению мембранного потенциала покоя после импульса. В примере на рис 3b также проявляет небольшую дополнительную деполяризацию мембраны после лазерного импульса. Шапиро и др.. 7 показано, что лазерной изменений мембранного потенциала, тесно связаны с локальных изменений температуры (например, температуры в непосредственной близости от клетки). Кроме того, модель, описываемая Томпсон и др. 27.определила, что при определенных условиях выравнивания, в результате диффузии осевых и радиальных градиентов температуры в освещенной области может привести к локальным колебаниям температуры напоминающий изменения мембранного потенциала, показанного на рисунке 3b. В результате этих выводов, считается, что положение клетки-мишени по сравнению с торца волокна света доставки играет существенную роль в определении как временной ход лазерного вызывало изменений мембранного потенциала, и максимальная температура в области ячейки.
Освещение с избыточной энергии или воздействия значительное увеличение температуры может привести к повреждению целевого нейрона. Это часто может наблюдаться через ухудшение клеточной электрических свойств (например, резкое увеличение тока, необходимого для поддержания мембранного потенциала на постоянном уровне, и / или значительное увеличение шума и нестабильность в сигнале). В крайнем случаес гибелью клеток происходит почти мгновенно при лазерном воздействии. рисунке 4 показаны напряжения зажим записи о смерти нейронов спирального ганглия в результате воздействия 25 мс, 8 мДж лазерного импульса.
Рисунок 1. Фазового контраста изображения, показывающие типичную нейронов ганглиев спирали и относительные положения оптического волокна и микропипетки (если смотреть сверху) в течение оптических экспериментах стимуляции.) Типичное нейронов ганглиев спирали. Б) оптического волокна в положение (изображение сфокусировано на верхней краю оптического волокна) в) Наложение изображения, показывающие волокно положении по отношению к клетке (примечание:. верхнему краю волокна слегка нависающих клетки т.е. Δ отрицательно). Как видно из выше, δ у и & Delта, являются радиального смещения центра нейрона от оси волокна и расстояния от верхнего края волокна к центру нейрон соответственно. Стрелки указывают положение нейронов ганглиев спирали. Масштабные линейки 20 мкм.
Рисунок 2. Схема экспериментальной установки для оптических экспериментов стимуляция (не в масштабе) Вставка:. Положение оптического волокна и микроэлектродом по отношению к клетке-мишени. θ, Δ и Z имеют значения, указанные в протоколе шаги 3.4.2 и 3.8.2.
Рисунок 3.) Фиксации потенциала (средний ответ от 6 лазерных импульсов Deliveкрасная со скоростью 1 Гц) и б) тока зажим (средний ответ от 16 лазерных импульсов повторяется со скоростью 4 Гц) записей из нейронов спирального ганглия показывает лазерной индуцированной изменения мембранного тока и мембранного потенциала при освещении 2,5 мсек , 0,8 мДж лазерного импульса. Заштрихованные области указывают сроки лазерного воздействия. Врезках ответов при лазерном освещении более подробно. Примечание: вставка) фокусируется на следы, полученные с мембранного потенциала -60 мВ. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 4. Напряжения зажим записи показывает гибель клеток в результате воздействия чрезмерно энергичными (25 мс, 8 мДж) лазерного импульса. Следует отметить, что амплитудаСигнал показано на нА и значительно больше, чем токи пА показано на рисунке 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование протоколов изложенных в настоящем документе, можно извлечь и культуре нейронов спирального ганглия и исследовать лазерной вызвало электрическую активность, выполняя целый экспериментов клетки патч зажим. При использовании в пробирке, технику патч зажим обеспечивает уровень контроля над экспериментальными параметрами, которые не достижимы в естественных условиях. Лазерная стимуляция параметров, таких как длина волны, энергия импульса, длительность импульса, форма импульса и последовательности импульсов могут быть изучены в воспроизводимой настройки. Кроме того, окружающая среда, в которой нейроны поддерживается (например, температура раствора химических факторов) может быть систематически разнообразным, что делает возможным изучение свойств мембраны и, следовательно, механизмы, лежащие в основе инфракрасных нейронной стимуляции. Взаимодействие электрических и оптических методов стимуляции также могут быть исследованы в управляемом режиме. Эти фундаментальные исследования могут быть усовершенствована путем введения FLлюминесцентных зондов для контроля дополнительных параметров, таких как концентрации ионов или экспрессию белков теплового шока. Четкое понимание этих различных параметров важно не только для достижения полного понимания этого явления, но и для достижения более эффективной стимуляции через процесс оптимизации.
В связи с важной ролью температуры в механизме INS 5-7, точное измерение локального нагрева из-за лазерной подсветкой имеет первостепенное значение в определении этого механизма 27. Подробный способ получения калиброванного измерения температуры путем регистрации тока, протекающего через открытую пипетки патч было описано Yao соавт. 28 и используется многими авторами, для определения величины и временной ход изменения лазерной индуцированной температуры в средах, представляющих эти найти в пробирке (например, см. Примечания 7, 8). Обеспечиватьд положение светового волокно доставки может быть точно определен (например, с использованием текущего протокола), этот метод измерения температуры, вероятно, возможность точного отображения локальное изменение температуры вследствие типичных стимула INS.
Длина волны лазерного стимулирующее является параметром, который следует рассматривать в INS экспериментах с лазерной индуцированной изменения температуры (и, следовательно, основные механизмы INS) опосредованы зависит от длины волны характеристик поглощения воды 7 (см. Thompson и соавт. 25 за Подробное обсуждение ожидаемых эффектов длины волны). Помимо 1870 нм лазерный диод, используемые в данном протоколе (инфракрасный нервов стимулятор, Optotech P / L), различные длины волн и лазерные пакеты были использованы другими авторами. Некоторые общие примеры лазеры, используемые в существующих публикациях модули: диодные лазеры с Aculight с длинами волн в диапазоне от 1,840-1,940 нм 6,7,10,13,16-18; Гольмиевый: YAG лазера (2,12 мкм) от лазерных 1-2-3 6,11,12,14,15 и диодных лазеров, работающих при 1875 5,8 нм, 1470 нм 8 и 1535 нм 8 из Sheaumann лазера.
Потенциальным недостатком применение этого метода в культивируемых нейронах ганглия спираль является то, что из-за относительно небольшого размера нейронов (~ 10-15 мкм в диаметре), запись электрод непосредственно освещенный лазера. Было высказано предположение, что лазерное освещение до определенного порога может изменить свойства записи цепи 7 (т.е. уплотнение и пипетки сопротивление). Шапиро и др.. 7 измерил этот порог путем мониторинга изменений в обратный потенциал кривых QV как лазерная мощность увеличилась, найти энергетический порог импульса 3 мДж. В качестве альтернативного подхода, то можно определить величину этого эффекта путем измерения суммарное сопротивление уплотнения и пипеткой в шОтверстие клетки режим (например, путем записи текущего ответ на 10 мс, +10 мВ импульса напряжения) при изменении температуры внеклеточного раствора. Для того чтобы полностью понять механизмы INS, жизненно важно, чтобы изменения лазерной индуцированной устойчивости измерять и учитывать.
На сегодняшний день большинство экспериментальных исследований, касающихся инфракрасного нервного возбуждения была предпринята в естественных условиях. В то время как сообщили пороги воздействия лучистого инфракрасного стимуляции в естественных условиях несколько варьироваться (например, 0,32 Дж -2 при 2,12 мкм для седалищного нерва крысы 1, <0,1 Дж -2 на 1,855 мкм для слуховых нервов песчанки 18), они значительно ниже, чем порог определяется через В лабораторных исследованиях (например, около 20 -2 Дж на 1,875 мкм для мыши ганглиозных клеток сетчатки и крысы вестибулярного ганглиозных клеток 5,8, 8,3 Дж/см2 для новорожденных крыс кардиомиопатиициты 9). На данном этапе детали INS процесса не достаточно хорошо понимают спекулировать о причинах этой разницы, однако, используя в пробирке моделей, таких как слуховые нейроны, которые очень похожи на цели предыдущей работе в естественных условиях может быть полезным в поиске объяснения .
Некоторые другие в пробирке моделей включают большие клетки, такие как ооциты Xenopus (~ 1 мм в диаметре), используемый Шапиро и др. 7. Это может быть полезно для исследования пространственных изменений в эффективности INS через отдельные клетки для того, чтобы исследовать ли клеточные компоненты находятся под влиянием стимуляцией. Более простые модели, такие как пузырьки липидного бислоя может позволить еще более точный контроль над экспериментальные параметры, чем в пробирке эксперименты, однако такие модели несколько ограничены по своим масштабам и не может показать всю сложность INS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа выполнена при поддержке Австралийского совета исследований при Связь грантового проекта LP120100264.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials and equipment | |||
| Glass coverslips | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
| 4-ring cell culture dish | VWR International | 82050-542 | |
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Curved forceps | WPI | 14101 | Dumont #5 tweezers (45° angle tip) |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Heracell 150i | |
| Table 1. Cell culture materials and equipment. | |||
| Neurobasal media | |||
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-149 | |
| Intracellular solution | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| Potassium hydroxide | LabServ | BSPPL738.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Extracellular solution | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 310166 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 383147 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Sodium hydroxide | LabServ | BSPSL740.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution. | |||
| Upright microscope | Zeiss | AxioExaminerD1 | Equipped with Dodt contrast |
| Water-immersion objective | Zeiss | W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75 | |
| Platform and X-Y stage | ThorLabs | Burleigh Gibraltar | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Vibration isolation table | TMC | Micro-g 63-532 | |
| CCD Camera | Diagnostic Instruments | RT1200 | |
| Camera software | Diagnostic Instruments | SPOT Basic | |
| In-line solution heater | Warner | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner | TC-324B | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Patch clamp data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Micropipette glass | Sutter Instruments | GBF100-58-15 | Borosilicate glass with filament |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P2000 | |
| Recording Software | AxoGraph | Lab pack and electrophysiology tools | |
| Aspirator bottle | Sigma-Aldrich | CLS12201L | 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing |
| PE Tubing | Harvard | PolyE #340 | |
| Masterflex peristaltic pump | Cole-Parmer | HV-07554-85 | |
| Table 3.Patch clamp equipment. | |||
| 1,870 nm laser diode | Optotech | ||
| 200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) | AFW Technologies | MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 | Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA |
| Optical fiber through connector (FC/PC) | Thorlabs | ADAFC2 | |
| Optical fiber cleaver | EREM | FO1 | |
| Optical fiber stripping tool (0.25 - 0.6 mm) | Siemens | For removing optical fiber jacket | |
| Optical fiber stripping tool (0.6 - 1.0 mm) | Siemens | For removing outer coating of patch cord | |
| Signal generator | Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered | ||
| Optical fiber positioner | Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments | ||
| Optical fiber chuck | Newport | FPH-DJ | |
| Laser power meter and detector head | Coherent | FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head) | |
| Table 4. Laser equipment. | |||
References
- Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. Application of infrared light for in vivo neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 10, 064003 (2005).
- Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser & Photonics Reviews. 5, 68-80 (2011).
- Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Current Opinion in Neurobiology. 19, 544-552 (2009).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Albert, E. S., et al. Trpv4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. Journal of Neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).
- Wells, J., et al. Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve. Biophysical Journal. 93, 2567-2580 (2007).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
- Bec, J. -M., et al. Characteristics of laser stimulation by near infrared pulses of retinal and vestibular primary neurons. Lasers in Surgery and Medicine. 44, 736-745 (2012).
- Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. Journal of Physiology (London). 589, 1295-1306 (2011).
- Izzo, A. D., et al. Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth. Biophysical Journal. 94, 3159-3166 (2008).
- Wells, J., Konrad, P., Kao, C., Jansen, E. D., Mahadevan-Jansen, A. Pulsed laser versus electrical energy for peripheral nerve stimulation. Journal of Neuroscience Methods. 163, 326-337 (2007).
- Teudt, I. U., Nevel, A. E., Izzo, A. D., Walsh, J. T., Richter, C. P. Optical stimulation of the facial nerve: A new monitoring technique. Laryngoscope. 117, 1641-1647 (2007).
- Jenkins, M. W., et al.
- Izzo, A. D., Richter, C. P., Jansen, E. D., Walsh, J. T.
- Izzo, A. D., et al. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: A comparison of optic and electric stimuli. J. Biomed. Opt. 12, 021008 (2007).
- Richter, C. P., et al. Optical stimulation of auditory neurons: Effects of acute and chronic deafening. Hearing Research. 242, 42-51 (2008).
- Littlefield, P. D., Vujanovic, I., Mundi, J., Matic, A. I., Richter, C. P. Laser stimulation of single auditory nerve fibers. Laryngoscope. 120, 2071-2082 (2010).
- Izzo, A. D., et al. Optical parameter variability in laser nerve stimulation: A study of pulse duration, repetition rate, and wavelength. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54, 1108-1114 (2007).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable-membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291, 1-14 (2012).
- Coleman, B., Fallon, J. B., Pettingill, L. N., de Silva, M. G., Shepherd, R. K. Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons. Experimental Cell Research. 313, 232-243 (2007).
- Whitlon, D. S., et al. Survival and morphology of auditory neurons in dissociated cultures of newborn mouse spiral ganglion. Neuroscience. 138, 653-662 (1016).
- Vieira, M., Christensen, B. L., Wheeler, B. C., Feng, A. S., Kollmar, R. Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice. Hearing Research. 230, 17-23 (2007).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. J. Vis. Exp. (36), e1685 (2010).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 17, 075002 (2012).
- Snyder, A. W., Love, J. D. Optical Waveguide Theory. , Chapman and Hall. (1983).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).
- Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies. Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).
