Encellede Mikroinjeksjon for Cell Communication analyse

Summary

Vi beskriver her hvordan du utfører en encellet mikroinjeksjon av Lucifer Yellow å visualisere mobil kommunikasjon via gap-kryss i levende celler, og gi noen nyttige tips. Vi forventer at denne artikkelen vil hjelpe alle til å vurdere graden av cellulær kobling grunn av funksjonelle gap veikryss. Alt som er beskrevet her kan være i prinsippet tilpasses andre fluorescerende fargestoffer med molekylvekt under 1000 Dalton.

Abstract

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

Introduction

Gap veikryss er inter kanaler som gjør at inter blant nabocellene ^1. Denne kommunikasjonen forbinder to eller flere tilstøtende celler, hvor hver av dem bidrar med en connexon eller hemichannel for å danne det intercellulære kanalen. I pattedyrceller, er connexon dannet av seks connexins, monomerer med fire transmembrane domener og et C-terminal og N i cytoplasmaet ^2. Gap junctions ikke bare tillate strøm av ioner, andre budbringere og små metabolitter, men også bidra til mange former for mobil kommunikasjon i mange fysiologiske prosesser, slik som synaptisk transmisjon, hjerte sammentrekning, cellevekst og differensiering ^{3, 4, 5, 6, 7, 8.} I tillegg gap junctions har vært forbundet medmange sykdommer, inkludert kreft ^{9, 10,} muskelatrofi ^11, noen genetiske sykdommer og demyeliniserende sykdommer ^12.

Denne type av intercellulære krysstale kan evalueres ved flere metoder ^{for 13, 14, 15, 16.} I denne artikkelen viser vi hvordan du utfører en encellet mikroinjeksjon av Lucifer Yellow å visualisere mobil kommunikasjon via gap-kryss i levende celler. Vi diskuterer hvordan å fremstille celler og mikropipette, bruken av mikromanipluatoren og injeksjon av Lucifer gult fargestoff i en tymisk epitel cellelinje. Vanligvis kan dette eksperimentelle fremgangsmåte analyseres ved gjennomsnittet av celler som er koblet til cellen lastet med fargestoff. I tillegg kan denne fremgangsmåte brukes sammen med andre fluorescerende fargestoffer med molekylvekt under gapetveikryss cut-off som er omtrent 1000 dalton.

Protocol

1. Utarbeidelse av celler Opprettholde en kultur av en tymisk epitel cellelinje (IT76M1) eller celle som skal testes i en inkubator (37 ° C / 5% CO2). Vask cellene med PBS 1x (gjenta dette elementet 3x). Legg Trypsin til cellene i 5 min. Legg medium (to ganger av volumet av trypsin tilsettes i punkt 1.3) med 10% FBS (føtalt bovint serum) til cellene med trypsin og sentrifuge (800 xg i 5 min). Telle celler i et hemocytometer. Justere tetthete…

Representative Results

Tymisk epitel cellelinje IT-76MI ble brukt for å evaluere fargestoff kopling av gap junctions som disse cellene ble beskrevet til å uttrykke funksjonelle gap junctions dannet ved connexin 43 21. Figur 1 viser injeksjon av Lucifer gult når de påføres i en celle under spissen av pipetten. Etter noen få minutter, som er koblet celler blir fluorescerende (stjerne) som indikerer diffusjon av det fluorescerende fargestoff gjennom gap veikryss. Antall celler og tid…

Discussion

For å verifisere tilstedeværelse av funksjonelle intercellulær gap junction, bruk av tracere, som er ugjennomtrengelig membran, selv om det permeable av intercellulære kanalene er nødvendig ^16. Fluorescein, den første fluorescerende fargestoff for å observere celle-til-celle-kopling ^22, er permeabel mellom ikke synaptiske membraner ³ og har derfor blitt erstattet av Lucifer gult fargestoff ^15. Tiden, for å finne det b…

Materials

Lucifer yellow	Sigma	L0259
Lithium Chloride	Sigma	L4408
PBS tablets	Sigma	P4417
RPMI	Sigma	R4130
Bovine fetal serum	Cultilab
Trypsin	Sigma	T4799
Microscope	Nikon	TE-2000	For microinjection experiments, one needs an inverted fluorescence microscope and filters for fluorescent microscopy
vibration-insulated table	Newport	VH3036W-OPT	A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage
Micromanipulator	Narishige	MMO-203	This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection.
Current Generator	Digitimer	DS2	To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations.