Microiniezione cella singola per l'analisi cellulare comunicazione

Summary

Descriviamo qui come eseguire una microiniezione cella singola di Lucifero giallo di visualizzare la comunicazione cellulare attraverso gap giunzioni nelle cellule viventi, e fornire alcuni suggerimenti utili. Ci aspettiamo che questo articolo vi aiuterà a tutti di valutare il grado di accoppiamento cellulare a causa di giunzioni funzionali. Tutto qui descritto potrebbe essere, in linea di principio, atto ad altri coloranti fluorescenti con peso molecolare inferiore a 1000 Daltons.

Abstract

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

Introduction

Giunzioni intercellulari sono canali che permettono l'intercomunicazione tra cellule vicine ^1. Questa comunicazione connette due o più celle confinanti, dove ognuno contribuisce con connessone o hemichannel per formare il canale intercellulare. In cellule di mammifero, la connessone è formata da sei connessine, monomeri con quattro domini transmembrana e un C e terminale N all'interno del citoplasma ^2. Giunzioni non solo permettono il flusso di ioni, secondi messaggeri e piccoli metaboliti, ma contribuiscono anche a molte forme di comunicazione cellulare in molti processi fisiologici, come la trasmissione sinaptica, contrazione cardiaca, la crescita e la differenziazione cellulare ^{3, 4, 5, 6, 7, 8.} Inoltre giunzioni sono stati associati conmolte malattie tra cui il cancro ^{9, 10, 11} atrofia muscolare, alcune malattie genetiche e malattie demielinizzanti ^12.

Questo tipo di crosstalk intercellulare può essere valutata mediante diversi metodi ^{13, 14, 15, 16.} In questo lavoro, si mostra come eseguire una microiniezione cella singola di Lucifero giallo di visualizzare la comunicazione cellulare attraverso gap giunzioni nelle cellule viventi. Discutiamo come preparare le cellule e la micropipetta, l'uso del micromanipolatore e l'iniezione di Lucifero colorante giallo in una linea di cellule epiteliali del timo. Solitamente, questa procedura sperimentale potrebbe essere analizzato dalla media delle celle collegate alla cella caricato con colorante. Inoltre, questo metodo può essere usato con altri coloranti fluorescenti con peso molecolare inferiore del gapgiunzioni cut-off, che è di circa 1.000 dalton.

Protocol

1. Preparazione di cellule Mantenere una cultura di una linea timica cellule epiteliali (IT76M1) o cellule da testare in un incubatore (37 ° C / 5% di CO 2). Lavare le cellule con PBS 1x (ripetere questo punto 3x). Aggiungere tripsina alle cellule per 5 min. Aggiungere mezzo (il doppio del volume di tripsina aggiunto al punto 1.3) con 10% FBS (siero bovino fetale) alle cellule con tripsina e centrifugare (800 xg per 5 min). Contare le cellule in un emo…

Representative Results

Timica linea di cellule epiteliali IT-76MI sono stati utilizzati per valutare l'accoppiamento colorante da giunzioni in quanto queste cellule sono state descritte per esprimere giunzioni funzionali formati da connessina 43 21. La Figura 1 mostra l'iniezione di Lucifer Yellow quando applicato in una cella sotto la punta della pipetta. Dopo alcuni minuti, celle collegate diventano fluorescenti (asterischi) indica la diffusione del colorante fluorescente attr…

Discussion

Al fine di verificare la presenza di funzionali gap junction intercellulare, l'uso di rivelatori, che sono membrana impermeabile, anche se permeabile da canali intercellulari sono necessari ^16. Fluoresceina, il primo colorante fluorescente per osservare cellula-cellula di accoppiamento ^22, è permeabile tra membrane non giunzionali ³ ed è stato quindi sostituito da Lucifer colorante giallo ^15. Attualmente, per trovare la…

Materials

Lucifer yellow	Sigma	L0259
Lithium Chloride	Sigma	L4408
PBS tablets	Sigma	P4417
RPMI	Sigma	R4130
Bovine fetal serum	Cultilab
Trypsin	Sigma	T4799
Microscope	Nikon	TE-2000	For microinjection experiments, one needs an inverted fluorescence microscope and filters for fluorescent microscopy
vibration-insulated table	Newport	VH3036W-OPT	A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage
Micromanipulator	Narishige	MMO-203	This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection.
Current Generator	Digitimer	DS2	To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations.