Одноклеточный Микроинъекция для анализа сотовой связи

Summary

Здесь мы опишем, как выполнить одноклеточного микроинъекции Lucifer Yellow для визуализации сотовой связи через гэп-переходов в живых клетках, а также обеспечить некоторые полезные советы. Мы ожидаем, что эта статья поможет всем оценить степень сотовой связью за счет функциональных щелевых контактов. Все, что описано здесь, может быть, в принципе, адаптированы к другим флуоресцентных красителей с молекулярной массой менее 1000 дальтон.

Abstract

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

Introduction

Щелевые соединения являются межклеточные каналы , которые позволяют междуэтажной среди соседних ячеек ^1. Эта связь соединяет два или более соседних ячеек, где каждый из них вносит свой вклад с коннексон или hemichannel, чтобы сформировать межклеточный канал. В клетках млекопитающих коннексон образован шестью коннексинами, мономеров с четырьмя трансмембранными доменами и С и N терминала в цитоплазме ^2. Щелевые контакты не только позволяют поток ионов, вторичных мессенджеров и малых метаболитов, а также способствуют многие формы сотовой связи во многих физиологических процессах, таких как синаптической передачи, сердечных сокращений, роста и дифференцировки ^{3, 4, 5, 6 клеток, 7, 8.} Кроме того щелевые соединения были связаны смногие заболевания , включая рак ^{9, 10, 11} , мышечной атрофии, некоторых генетических заболеваний и демиелинизирующих заболеваний ^12.

Этот тип межклеточного перекрестных помех может быть оценена несколькими способами ^{13, 14, 15, 16.} В этой статье мы покажем, как выполнить одноклеточного микроинъекции Lucifer Yellow для визуализации сотовой связи через гэп-переходов в живых клетках. Мы обсудим, как подготовить клетки и микропипетки, использование микроманипулятора и инъекцию Люцифера желтого красителя в вилочковой эпителиальной клеточной линии. Как правило, эта экспериментальная процедура может быть проанализирована с помощью среднего связанных клеток к клетке, нагруженной красителем. Кроме того, этот способ может быть использован с другими флуоресцентными красителями, с молекулярной массой ниже зазораперекрестки отсечение, который составляет примерно 1000 Дальтон.

Protocol

1. Получение клеток Поддерживать культуру вилочковой эпителиальной клеточной линии (IT76M1) или клетки должны быть испытаны в инкубаторе (37 ° C / 5% CO 2). Вымойте клеток с PBS 1x (повторить этот пункт 3x). Добавить трипсина в клетки в течение 5 мин. Добавить среду (в два…

Representative Results

Тимуса эпителиальные клетки линии IT-76MI были использованы для оценки сцепления красителя щелевых контактов , как эти клетки были описаны , чтобы выразить функциональные щелевые соединения , образованные коннексина 43 21. На рисунке 1 показана инъекцию Lucifer Yel…

Discussion

Для того чтобы проверить наличие функциональной межклеточного щелевых контактов, использование изотопных индикаторов, которые мембрана непроницаема, хотя проницаемой межклеточные каналы необходимы ^16. Флуоресцеин, первый флуоресцентный краситель для наблюдения от клет…

Materials

Lucifer yellow	Sigma	L0259
Lithium Chloride	Sigma	L4408
PBS tablets	Sigma	P4417
RPMI	Sigma	R4130
Bovine fetal serum	Cultilab
Trypsin	Sigma	T4799
Microscope	Nikon	TE-2000	For microinjection experiments, one needs an inverted fluorescence microscope and filters for fluorescent microscopy
vibration-insulated table	Newport	VH3036W-OPT	A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage
Micromanipulator	Narishige	MMO-203	This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection.
Current Generator	Digitimer	DS2	To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations.