حقن مكروي وحيدة الخلية لتحليل الاتصالات خلية

Summary

نحن هنا وصف كيفية إجراء حقن مكروي وحيدة الخلية لوسيفر الأصفر لتصور الاتصالات الخلوية عبر الفجوة تقاطعات في الخلايا الحية، وتقديم بعض النصائح المفيدة. ونحن نتوقع أن هذه الورقة سوف تساعد الجميع لتقييم درجة اقتران الخلوية بسبب تقاطعات الفجوة الوظيفية. كل شيء الموصوفة هنا يمكن أن يكون، من حيث المبدأ، وتكييفها لالأصباغ الفلورية الأخرى مع الوزن الجزيئي أقل من 1000 دالتون.

Abstract

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

Introduction

تقاطعات الفجوة هي قنوات intercellular التي تسمح للالتواصل بين الخلايا المجاورة ^1. هذا التواصل يربط اثنين أو أكثر من الخلايا المجاورة، حيث يساهم كل واحد مع connexon أو hemichannel لتشكيل قناة intercellular. في خلايا الثدييات، ويتم تشكيل connexon ستة connexins، أحادية مع أربعة مجالات الغشاء وC ومحطة N داخل السيتوبلازم ^2. تقاطعات الفجوة لا تسمح فقط تدفق الأيونات، رسل الثانية والأيض صغيرة، ولكن تسهم أيضا في العديد من أشكال الاتصالات الخلوية في العديد من العمليات الفسيولوجية، مثل انتقال متشابك، تقلص القلب ونمو الخلايا والتمايز ^{3، 4، 5، 6، 7، 8.} وبالإضافة إلى ذلك ارتبطت تقاطعات الفجوة معالعديد من الأمراض بما فيها السرطان ^{9، 10، 11} ضمور العضلات، وبعض الأمراض الوراثية والمزيل للأمراض ^(12).

هذا النوع من الحديث المتبادل intercellular يمكن تقييمها من قبل العديد من الطرق ^{13، 14، 15، 16.} في هذه الورقة، وتبين لنا كيفية إجراء حقن مكروي وحيدة الخلية لوسيفر الأصفر لتصور الاتصالات الخلوية عبر الفجوة تقاطعات في الخلايا الحية. نناقش كيفية تحضير الخلايا وmicropipette، واستخدام وmicromanipulator وحقن لوسيفر الصبغة الصفراء في خط الخلايا الظهارية الغدة الصعترية. عادة، يمكن تحليل هذا الإجراء التجريبي من المتوسط ​​من خلايا مرتبطة إلى الخلية محملة صبغ. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا الأسلوب مع الأصباغ الفلورية الأخرى مع الوزن الجزيئي أقل من الفجوةتقاطعات قطع وهو ما يقرب من 1000 دالتون.

Protocol

1. إعداد الخلايا الحفاظ على الثقافة من خط الغدة الصعترية الخلايا الظهارية (IT76M1) أو خلية لفحصها في حاضنة (37 ° C / 5٪ CO 2). غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X (اكرر هذا البند 3X). <li style=";text-alig…

Representative Results

استخدمت الغدة الصعترية خط الخلايا الظهارية IT-76MI لتقييم اقتران صبغ من قبل تقاطعات الفجوة كما وصفت هذه الخلايا للتعبير عن تقاطعات الفجوة الوظيفية التي شكلتها connexin 43 21. ويبين الشكل (1) وحقن لوسيفر الأصفر عند تطبيقها في خلية واحدة تحت غيض من…

Discussion

من أجل التحقق من وجود وظيفية تقاطع الفجوة بين الخلايا، واستخدام استشفاف، وهي غشاء كتيمة، وإن قابلة للاختراق من قبل قنوات بين الخلايا المطلوبة ^16. فلوريسئين، أول صبغة الفلورسنت لمراقبة الخلية الى خلية اقتران ^22، غير قابلة للاختراق بين الأغشي?…

Materials

Lucifer yellow	Sigma	L0259
Lithium Chloride	Sigma	L4408
PBS tablets	Sigma	P4417
RPMI	Sigma	R4130
Bovine fetal serum	Cultilab
Trypsin	Sigma	T4799
Microscope	Nikon	TE-2000	For microinjection experiments, one needs an inverted fluorescence microscope and filters for fluorescent microscopy
vibration-insulated table	Newport	VH3036W-OPT	A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage
Micromanipulator	Narishige	MMO-203	This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection.
Current Generator	Digitimer	DS2	To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations.