Eencellige micro-injectie voor mobiele Communicatie Analyse

Summary

We beschrijven hier hoe je een eencellige micro-injectie van Lucifer Yellow uit te voeren om cellulaire communicatie via gap-junctions te visualiseren in levende cellen, en een aantal nuttige tips. We verwachten dat dit artikel iedereen zal helpen om de mate van cellulaire koppeling te evalueren door functionele gap junctions. Alles hier beschreven kan zijn, in principe, aangepast aan andere fluorescente kleurstoffen met een molecuulgewicht onder 1000 Dalton.

Abstract

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

Introduction

Gap junctions zijn intercellulaire kanalen die de onderlinge communicatie mogelijk maken tussen naburige cellen ^1. Deze mededeling verbindt twee of meer naburige cellen, waarbij elk bijdraagt ​​met een connexon of hemikanaal aan de intercellulaire kanaal te vormen. In zoogdiercellen is de connexon gevormd door zes connexines, monomeren met vier transmembraandomeinen en een C- en N-terminale binnen het cytoplasma ^2. Gap junctions niet alleen mogelijk de stroom van ionen, second messengers en kleine metabolieten, maar ook bij vele vormen van cellulaire communicatie in vele fysiologische processen, zoals synaptische transmissie, hart contractie, celgroei en differentiatie ^{3, 4, 5, 6, 7, 8.} Daarnaast zijn gap junctions geassocieerd metveel ziekten waaronder kanker ^{9, 10, 11} spieratrofie, sommige genetische ziekten en demyelineringsziekten ^12.

Dit type intercellulaire overspraak kan worden geëvalueerd door verscheidene werkwijzen ^{13, 14, 15, 16.} In dit artikel laten we zien hoe een eencellige micro-injectie van Lucifer Yellow uit te voeren om cellulaire communicatie via gap-junctions te visualiseren in levende cellen. We bespreken hoe de cellen en de micropipet, het gebruik van de micromanipulator en de injectie van Lucifer Yellow kleurstof in een thymus epitheelcellijn bereiden. Meestal kan deze experimentele procedure wordt geanalyseerd door de gemiddelde geschakelde cellen met de cel geladen met kleurstof. Bovendien kan deze methode worden gebruikt met andere fluorescente kleurstoffen met een molecuulgewicht onder de spleetknooppunten cut-off die ongeveer 1.000 dalton.

Protocol

1. Bereiding van Cellen Handhaaf een kweek van een thymus epitheelcellijn (IT76M1) of te testen cel in een incubator (37 ° C / 5% CO 2). Was de cellen met PBS 1x (herhaal dit item 3x). Trypsine toevoegen aan de cellen gedurende 5 min. voeg medium (tweemaal de hoeveelheid trypsine toegevoegd punt 1,3) met 10% FBS (foetaal runderserum) aan de cellen met trypsine en gecentrifugeerd (800 xg gedurende 5 minuten). Tel de cellen in een hemocytometer. <li…

Representative Results

Thymus epitheel cellijn IT-76MI werden gebruikt om kleurstof koppeling te evalueren door gap junctions als deze cellen werden beschreven functionele gap junctions gevormd door connexine 43 21 uit te drukken. Figuur 1 toont de injectie van Lucifer Yellow wanneer toegepast in een cel onder de punt van de pipet. Na enkele minuten, verbonden cellen fluorescentie (sterretjes) die de diffusie van de fluorescerende kleurstof via gap junctions. Het aantal cellen en de tij…

Discussion

Om de aanwezigheid van functionele intercellulaire gap junction, het gebruik van tracers die ondoorlaatbaar membraan zijn te verifiëren, maar permeabel door intercellulaire kanalen ¹⁶ vereist. Fluoresceïne, de eerste fluorescerende kleurstof te observeren cel-cel koppeling ^22, permeabel tussen niet junctional ³ membranen en is derhalve vervangen door Lucifer Yellow ¹⁵ kleurstof. Op dit moment, op zoek naar de beste keuze ui…

Materials

Lucifer yellow	Sigma	L0259
Lithium Chloride	Sigma	L4408
PBS tablets	Sigma	P4417
RPMI	Sigma	R4130
Bovine fetal serum	Cultilab
Trypsin	Sigma	T4799
Microscope	Nikon	TE-2000	For microinjection experiments, one needs an inverted fluorescence microscope and filters for fluorescent microscopy
vibration-insulated table	Newport	VH3036W-OPT	A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage
Micromanipulator	Narishige	MMO-203	This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection.
Current Generator	Digitimer	DS2	To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations.