Microinjection unique cellule pour l'analyse cellulaire de communication

Summary

Nous décrivons ici comment effectuer une microinjection seule cellule de Lucifer Jaune pour visualiser la communication cellulaire via gap-jonctions dans les cellules vivantes, et de fournir quelques conseils utiles. Nous nous attendons à ce que ce document aidera tout le monde à évaluer le degré de couplage cellulaire en raison de jonctions lacunaires fonctionnels. Tout ce qui est décrit ici pourrait être, en principe, adapté à d'autres colorants fluorescents ayant un poids moléculaire inférieur à 1000 Daltons.

Abstract

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

Introduction

Les jonctions lacunaires sont des canaux intercellulaires qui permettent l'intercommunication entre les cellules voisines ^1. Cette communication relie deux ou plusieurs cellules voisines, où chacun contribue avec un connexon ou hemichannel pour former le canal intercellulaire. Dans les cellules de mammifères, l'connexon est formé par six connexines, des monomères avec quatre domaines transmembranaires et un C et N terminaux dans le cytoplasme ^2. Les jonctions lacunaires permettent non seulement le flux d'ions, les seconds messagers et de petits metabolites, mais contribuent également à de nombreuses formes de communication cellulaire dans de nombreux processus physiologiques, tels que la transmission synaptique, la contraction du coeur, la croissance et la différenciation cellulaire ^{3, 4, 5, 6, 7, 8.} En outre jonctions lacunaires ont été associées àde nombreuses maladies telles que le cancer ^{9, 10, 11} l' atrophie musculaire, certaines maladies génétiques et des maladies démyélinisantes ^12.

Ce type de diaphonie intercellulaire peut être évaluée par plusieurs méthodes ^{13, 14, 15, 16.} Dans cet article, nous montrons comment effectuer une microinjection seule cellule de Lucifer Jaune pour visualiser la communication cellulaire via gap-jonctions dans les cellules vivantes. Nous discutons de la façon de préparer les cellules et la micropipette, l'utilisation du micromanipulateur et l'injection de Lucifer colorant jaune dans une lignée de cellules épithéliales du thymus. En général, cette procédure expérimentale pourrait être analysé par la moyenne des cellules connectées à la cellule chargée avec un colorant. En outre, ce procédé pourrait être utilisé avec d'autres colorants fluorescents ayant un poids moléculaire inférieur à l'écartjonctions de coupure qui est d'environ 1000 daltons.

Protocol

1. Préparation des cellules Maintenir une culture d'une lignée de cellules épithéliales du thymus (IT76M1) ou d'une cellule à tester dans un incubateur (37 ° C / 5% de CO 2). Laver les cellules avec du PBS 1x (répéter cet article 3x). Ajouter à la trypsine les cellules pendant 5 min. Ajouter du milieu (deux fois le volume de la trypsine ajoutée à l'article 1.3) avec 10% de FBS (sérum bovin fœtal) aux cellules avec de la trypsine et de cen…

Representative Results

Lignée de cellules épithéliales thymiques IT-76MI ont été utilisés pour évaluer le couplage de colorant par des jonctions lacunaires que ces cellules ont été décrites pour exprimer des jonctions lacunaires fonctionnels formés par les connexines 43 21. La figure 1 montre l'injection de jaune Lucifer lorsqu'elle est appliquée dans une cellule au-dessous de la pointe de la pipette. Au bout de quelques minutes, les cellules connectées deviennent f…

Discussion

Afin de vérifier la présence de intercellulaire fonctionnelle jonction lacunaire, l'utilisation de traceurs, qui sont membrane imperméable, bien perméable par des canaux intercellulaires sont nécessaires ^16. Fluorescéine, le premier colorant fluorescent pour l' observation de cellule à cellule de couplage ²² est perméable entre les membranes non jonctionnels ³ et a par conséquent été remplacé par Lucifer Yellow ^…

Materials

Lucifer yellow	Sigma	L0259
Lithium Chloride	Sigma	L4408
PBS tablets	Sigma	P4417
RPMI	Sigma	R4130
Bovine fetal serum	Cultilab
Trypsin	Sigma	T4799
Microscope	Nikon	TE-2000	For microinjection experiments, one needs an inverted fluorescence microscope and filters for fluorescent microscopy
vibration-insulated table	Newport	VH3036W-OPT	A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage
Micromanipulator	Narishige	MMO-203	This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection.
Current Generator	Digitimer	DS2	To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations.