Microinjeção de uma única célula para análise da comunicação celular

Summary

Descrevemos aqui como executar uma microinjeção de uma única célula de Lucifer Yellow visualizar comunicação celular via gap-junções em células vivas, e fornecer algumas dicas úteis. Esperamos que este trabalho irá ajudar a todos para avaliar o grau de acoplamento celular devido à junções comunicantes funcionais. Tudo o descrito aqui pode ser, em princípio, adaptado para outros corantes fluorescentes com peso molecular inferior a 1.000 Daltons.

Abstract

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

Introduction

As junções de hiato são canais intercelulares que permitem a intercomunicação entre células vizinhas ^1. Esta comunicação conecta duas ou mais células vizinhas, onde cada um contribui com um connexon ou hemichannel para formar o canal intercelular. Em células de mamíferos, o connexon é formado por seis conexinas, monómeros com quatro domínios transmembranares e um terminal de C e N dentro do citoplasma ^2. As junções de hiato não só permitir o fluxo de iões, segundos mensageiros e pequenos metabolitos, mas também contribuir para muitas formas de comunicação celular em muitos processos fisiológicos, tais como a transmissão sináptica, a contracção cardíaca, crescimento e diferenciação celular ^{3, 4, 5, 6, 7, 8.} Além disso as junções de hiato foram associados commuitas doenças incluindo cancro ^{9, 10, 11,} atrofia muscular, algumas doenças genéticas e doenças desmielinizantes ^12.

Este tipo de interferência intercelular pode ser avaliada através de vários métodos ^{13, 14, 15, 16.} Neste artigo, vamos mostrar como realizar uma microinjeção de uma única célula de Lucifer Yellow visualizar comunicação celular via gap-junções em células vivas. Discute-se como preparar as células e a micropipeta, a utilização do micromanipulador e a injecção do corante Amarelo Lúcifer em uma linha de células epiteliais do timo. Normalmente, este procedimento experimental poderia ser analisados ​​pela média de células ligadas à célula carregado com corante. Além disso, este método pode ser usado com outros corantes fluorescentes com peso molecular inferior a lacunajunções de corte, que é cerca de 1.000 daltons.

Protocol

1. Preparação de células Manter uma cultura de uma linha celular epitelial tímica (IT76M1) ou célula a ser testada numa incubadora (37 ° C / 5% de CO 2). Lave as células com PBS 1x (repetir este item 3x). Adicionar tripsina às células durante 5 min. Adicionar meio (o dobro do volume de tripsina adicionada no ponto 1.3) com 10% de FBS (soro fetal bovino) para as células com tripsina e centrifugação (800 xg durante 5 min). Contar as células n…

Representative Results

Tímico linha celular epitelial de TI-76MI foram usadas para avaliar corante de acoplamento por junções de hiato como estas células foram descritos para expressar junções de hiato funcionais formados por conexina 43 21. A Figura 1 mostra a injecção de Amarelo Lúcifer quando aplicado na uma célula abaixo da ponta da pipeta. Após alguns minutos, as células tornam-se ligados fluorescente (asteriscos), indicando a difusão do corante fluorescente através d…

Discussion

A fim de verificar a presença de junções de hiato funcionais intercelular, a utilização de marcadores, que são membrana impermeável, embora permeável por meio de canais intercelulares são necessários ^16. Fluoresceína, o primeiro corante fluorescente para observar célula-a-célula de acoplamento ^22, é permeável entre membranas não juncionais ³ e, por conseguinte, tem sido substituído por Lúcifer corante Amarelo ^15.<…

Materials

Lucifer yellow	Sigma	L0259
Lithium Chloride	Sigma	L4408
PBS tablets	Sigma	P4417
RPMI	Sigma	R4130
Bovine fetal serum	Cultilab
Trypsin	Sigma	T4799
Microscope	Nikon	TE-2000	For microinjection experiments, one needs an inverted fluorescence microscope and filters for fluorescent microscopy
vibration-insulated table	Newport	VH3036W-OPT	A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage
Micromanipulator	Narishige	MMO-203	This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection.
Current Generator	Digitimer	DS2	To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations.