Gemakkelijk Meting van diffusiecoëfficiënten van EGFP-gelabeld plasmamembraaneiwitten gebruik van K-Space Beeld Correlatie Spectroscopie
Summary
Dit artikel geeft een stap voor stap handleiding om de fluctuatie analysetechniek k-Ruimte Beeld Correlatie Spectroscopie (KIG's) voor het meten van diffusiecoëfficiënten van fluorescent gelabelde plasmamembraan eiwitten in levende cellen van zoogdieren.
Abstract
Laterale diffusie en compartimentering van plasmamembraan eiwitten worden strak gereguleerd in cellen en dus, het bestuderen van deze processen zullen nieuwe inzichten onthullen plasmamembraaneiwit functie en regulatie. Onlangs, k-Ruimte Beeld Correlatie Spectroscopie (KIG's) 1 is ontwikkeld om routinematige metingen van diffusiecoëfficiënten staat rechtstreeks van beelden van fluorescent gelabelde plasmamembraaneiwitten, dat systematische fouten geïntroduceerd door sonde fotofysica vermeden. Hoewel de theoretische basis voor de analyse is complex, kan de werkwijze worden uitgevoerd door nonexperts met een vrij verkrijgbaar code diffusie coëfficiënten van proteïnen te meten. KIG berekent een tijd correlatie functie van een fluorescentie microscopie afbeelding stapel na Fourier transformatie van elk beeld om wederzijdse (k-) ruimte. Vervolgens circulaire middeling, natuurlijke logaritme transformeren en lineaire past om de correlatie functie levert de diffusiecoëfficiënt. Dezepapier zorgt voor een stap-voor-stap handleiding voor de beeldanalyse en meting van diffusiecoëfficiënten via KIG's.
Eerst wordt een hoge framesnelheid beeld sequentie van een fluorescent gemerkt plasmamembraaneiwit verkregen met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Vervolgens wordt een regio van belang (ROI) te vermijden intracellulaire organellen, bewegende blaasjes of uitstekende membraan regio geselecteerd. De ROI stack wordt geïmporteerd in een vrij beschikbare code en een aantal gedefinieerde parameters (zie methode sectie) ingesteld voor de KIG analyse. Het programma genereert vervolgens een "helling pistes" plot van de k-ruimte tijd correlatie functies, en de diffusie coëfficiënt wordt berekend uit de helling van het perceel. Hieronder is een stap-voor-stap KIG procedure om de diffusie coëfficiënt van een membraan eiwit meten met behulp van de renale waterkanaal aquaporine-3 gelabeld met EGFP als een canonieke voorbeeld.
Introduction
De vierdimensionale spatiotemporele organisatie en laterale mobiliteit van plasmamembraaneiwitten zijn strak gereguleerd en kan een rol spelen in eiwitfunctie, activiteit en eiwit-eiwit interacties. Laterale diffusie van plasmamembraan eiwitten, is van oudsher bestudeerd door het berekenen diffusiecoëfficiënten voor enkele deeltjes van time-lapse imaging van quantum dot of kleurstof gelabelde plasmamembraaneiwitten 2-4. Deze benadering vereist het inbrengen van een extracellulair tag in de plasmamembraan eiwit quantum dot of kleurstof etikettering, die eiwitvouwing en functie kunnen beschadigen en derhalve niet kan worden bereikt voor sommige eiwitten. Het sterische volume van een quantum dot is aangetoond vertragen diffusie van het proteïne 5 en bovendien slechts een fractie van de eiwitten in de populatie zijn gelabeld met quantum dots, en het is niet bekend of deze fractie is representatief voor de totale pool van plasmamembraaneiwitten. Enkel deeltje tracking (SPT) metingen van diffusiecoëfficiënten uit beeld-serie van quantum dot gelabelde eiwitten betreft het in kaart brengen van de afgebeelde top posities van de deeltjes met twee dimensionale Gauss-fits gevolgd door uitgebreide analyse algoritmen. De analyse is computationeel zeer intensief, die uitgebreide niet-lineaire curve fitting in elk beeld frame van een time-lapse volgorde om benaderingen van de microscoop puntspreidingsfunctie (meestal twee dimensionale ruimtelijke Gaussians) en daaropvolgende koppeling van deeltje posities in deeltjestrajecten beschrijven van de beweging van enkele moleculen 6,7.
Een recent ontwikkelde beeldcorrelatie techniek, k-Ruimte Beeld Correlatie Spectroscopie (KIG's) maakt relatieve eenvoudige metingen van diffusiecoëfficiënten van fluorescent gelabeld plasmamembraan eiwitten. De mogelijkheid om routinematig berekenen diffusiecoëfficiënten van membraaneiwitten gelabeld met fluorescerende eiwitten door KIG is een unieke tool die houdteen aantal voordelen ten opzichte van traditionele quantum dot SPT analyse: geen invoeging van extracellulaire tags en tijdrovend extracellulaire etikettering vereist (cellijnen die fluorescerende eiwitten kunnen worden gebruikt); diffusie coëfficiënten worden uit de totale verzameling van fluorescente proteïnen ten opzichte van een subset gelabeld met quantum dots; analyse is eenvoudig zonder dat enige proteïnen volgen en de analyse kan worden uitgevoerd met een bestaande code zonder behoefte aan extra gebruikersprogrammering. De werkwijze is snel omdat het een gemiddelde techniek die snelle berekening en de berekening van diffusiecoëfficiënten maakt. Deze snelle verspreiding metingen voor het eiwit bevolking aanvulling op de meer gedetailleerde informatie moleculair transport voor een subset van de populatie verkregen door het zorgvuldige SPT methoden.
KIG tijd correleert fluorescentie microscopie afbeelding sequenties die van tevoren zijn omgevormd tot Fourier ruimte, en daardoor scheidt fluorescence schommelingen als gevolg van fotofysica uit die als gevolg van moleculaire vervoer 1. Hierdoor kan het aantal KIG dichtheid te bepalen, luchtsnelheid en verspreiding van fluorescent gelabelde moleculen terwijl onpartijdige door complexe fotobleken of knipperen van de fluoroforen. Dit maakt KIG een nuttig hulpmiddel voor het snel de verspreiding dynamiek van fluorescent gelabelde celmembraan eiwitten bepalen zonder aangepaste schrijven algoritmen. Naast fluorescent gelabelde eiwitten KIG kan ook worden toegepast op quantum dot-gemerkte membraaneiwitten 8.
Dit document biedt een stap-voor-stap introductie van hoe KIG gebruiken om diffusiecoëfficiënten van EGFP-gelabeld plasmamembraaneiwitten halen door aan te tonen hoe het gewas te plaatsen, hoe je de code en hoe u de gegenereerde percelen, te evalueren gebruiken waaruit diffusie coëfficiënten worden gewonnen. Als voorbeeld, gegevens verkregen door het draaien van schijf-microscopie set in semi-totale interne reflectie fluorescerenNVU (TIRF) modus van een nier waterkanaal eiwit aquaporin-3 (AQP3) getagged met EGFP wordt gepresenteerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze paper gepresenteerd uitvoerige stap-voor-stap overzicht van hoe de KIG analysemethode gelden voor diffusie coëfficiënt te bepalen van microscopie beelden van eiwitten gelabeld met fluorescerende eiwitten. De analyse is onafhankelijk probe keuze met een zeer breed dynamisch bereik etikettering dichtheid en kan dus ook worden toegepast op eiwitten gelabeld met quantum dots en kleurstoffen en fluorescerende eiwitten zoals EGFP.
Geldige diffusie coëfficiënten voor de berekening van eiwi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een Lundbeck Junior groepsleider Fellowship te LNN. PWW erkent subsidies steun van de Natuurwetenschappen en Engineering Research Council of Canada (NSERC). We danken ook de Deense Molecular Bioimaging Center aan de Universiteit van Zuid-Denemarken voor de toegang tot spinning disk microscopie.
Materials
Referências
- Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics. Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).
- Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots. Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
- Pinaud, F., et al. Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking. Traffic. 10, 691-712 (2009).
- Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations. Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).
- Durisic, N., et al. Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules. Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).
- Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera. Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).
- Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus. The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).
- Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys J. 92, 613-621 (2007).
- Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).
- Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Løcke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion. Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).
