Facile Misura di diffusione Coefficienti di EGFP-tagged plasma proteine di membrana Uso k-spazio Spettroscopia di correlazione Immagine
Summary
Questo documento fornisce una guida passo per passo per la tecnica di analisi fluttuazione k-Image Space Correlation Spectroscopy (CCI) per misurare i coefficienti di diffusione delle fluorescente proteine di membrana plasmatica in cellule di mammifero vive.
Abstract
Diffusione laterale e la compartimentalizzazione delle proteine di membrana del plasma sono strettamente regolati nelle cellule e, quindi, lo studio di questi processi saranno rivelare nuovi spunti per la funzione delle proteine di membrana plasmatica e la regolamentazione. Recentemente, k-spazio correlazione Immagine Spectroscopy (CCI) 1 è stato sviluppato per consentire misurazioni di routine di coefficienti di diffusione direttamente dalle immagini delle proteine di membrana plasmatica con targhetta modo fluorescente, che evitate distorsioni sistematiche introdotte dal fotofisica sonda. Sebbene la base teorica per l'analisi è complessa, il metodo può essere implementato da non esperti utilizzando un codice liberamente disponibile per misurare coefficienti di diffusione di proteine. CCI calcola una funzione di correlazione tempo da una pila di microscopia a fluorescenza dopo trasformazione di Fourier di ogni immagine reciproca spazio (k-). Successivamente, media circolare, logaritmo naturale trasformare e lineare adatta per la funzione di correlazione produce il coefficiente di diffusione. Questodocumento fornisce una guida step-by-step per l'analisi delle immagini e la misurazione dei coefficienti di diffusione via CCI.
In primo luogo, un frame rate elevato sequenza di immagini di una proteina di membrana plasmatica fluorescente viene eseguita utilizzando un microscopio a fluorescenza. Poi, è selezionata una regione di interesse (ROI) evitando organelli intracellulari, vescicole mobili o sporgenti regioni di membrana. Lo stack ROI viene importato in un codice liberamente disponibile e diversi parametri definiti (vedi sezione Method) sono impostati per l'analisi CCI. Il programma genera quindi un "pendio di piste" complotto dalle funzioni di tempo di correlazione k-spazio, e il coefficiente di diffusione è calcolato dalla pendenza del grafico. Qui di seguito è una procedura step-by-step CCI per misurare il coefficiente di diffusione di una proteina di membrana utilizzando l'renale canale di acqua aquaporin-3 con etichetta EGFP come un esempio canonico.
Introduction
L'organizzazione spazio-temporale quadridimensionale e mobilità laterale delle proteine di membrana di plasma sono strettamente regolati e possono svolgere un ruolo nella funzione della proteina, l'attività e le interazioni proteina-proteina. Diffusione laterale delle proteine di membrana del plasma, è tradizionalmente stata studiata calcolando i coefficienti di diffusione per singole particelle di time-lapse imaging di quantum dot o tingere etichettati proteine della membrana plasmatica 2-4. Questo approccio richiede l'inserimento di un tag extracellulare della proteina di membrana plasmatica per quantum dot o etichettatura colorante, che può compromettere folding e la funzione e, quindi, non può essere raggiunto per alcune proteine. Il volume sterico di un punto quantico ha dimostrato di rallentare la diffusione della proteina 5 ed inoltre, solo una piccola frazione delle proteine nella popolazione rechino punti quantici, e non è noto se la frazione è rappresentativa del totale pool di proteine di membrana plasmatica. TRA singola particellacking (SPT) misurazioni dei coefficienti di diffusione di immagine serie di proteine marcate quantum dot coinvolge la mappatura delle posizioni di punta impressi delle particelle con bidimensionale gaussiano si adatta seguiti da ampie algoritmi di analisi. L'analisi è computazionalmente molto intenso, che richiede un'ampia curva non lineare adatta in ogni fotogramma l'immagine di una sequenza di time-lapse per approssimazioni della funzione microscopio punto di spread (tipicamente bidimensionale gaussiane spaziale) e il successivo collegamento delle posizioni delle particelle in traiettorie delle particelle descrive l' moto delle singole molecole 6,7.
Un'immagine tecnica di correlazione sviluppata di recente, k-spazio Image Correlation Spectroscopy (CCI) permette semplici misurazioni relative di coefficienti di diffusione di fluorescenza tagged proteine di membrana del plasma. La possibilità di calcolare regolarmente coefficienti di diffusione delle proteine di membrana marcate con proteine fluorescenti da CCI è uno strumento unico che tienediversi vantaggi rispetto quantum dot tradizionale analisi SPT: Non è richiesto alcun inserimento di tag extracellulari e richiede tempo etichettatura extracellulare (linee cellulari che esprimono proteine fluorescenti possono essere utilizzati); coefficienti di diffusione sono estratti dal pool totale di proteine fluorescenti rispetto a un sottoinsieme etichettato con punti quantici; analisi è semplice, senza la necessità di monitorare singole proteine e l'analisi può essere eseguita utilizzando un codice esistente senza necessità di programmazione utente aggiuntivo. Il metodo è veloce perché è una tecnica che permette il calcolo della media veloce e calcolo dei coefficienti di diffusione. Queste misure diffusione rapidi per la popolazione proteina completano le informazioni più dettagliate trasporto molecolare ottenuto per un sottoinsieme della popolazione dai metodi SPT scrupoloso.
tempo CCI correla microscopia a fluorescenza sequenze di immagini che sono stati prima trasformati in spazio di Fourier, e quindi separa flfluttuazioni uorescence dovute a fotofisica da quelli dovuti al trasporto molecolare 1. Come risultato, CCI possono determinare la densità numerica, velocità di flusso, e la diffusione di fluorescente molecole marcate pur essendo distorti da fotoscolorimento complesso o lampeggiante dei fluorofori. Questo rende CCI uno strumento utile per determinare rapidamente la dinamica di diffusione di proteine della membrana cellulare fluorescenza marcata senza la necessità di algoritmi di scrittura personalizzati. Proteine Oltre fluorescente, CCI possono essere applicate anche a Quantum Dot-marcato proteine di membrana 8.
Questo documento fornisce un'introduzione step-by-step di come usare CCI per estrarre i coefficienti di diffusione delle proteine di membrana plasmatica EGFP-taggate dimostrando come posizionare il raccolto, come utilizzare il codice e come valutare le trame generate, da cui diffusione coefficienti vengono estratti. Come esempio, i dati ottenuti facendo girare insieme di dischi-microscopia a riflessione interna totale semi-fluorescenzaModalità nce (TIRF), di una proteina renale canale di acqua aquaporin-3 (AQP3) con etichetta EGFP è presentato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo documento presenta una panoramica dettagliata passo-passo su come applicare il metodo di analisi CCI per determinare i coefficienti di diffusione di immagini di microscopia di proteine marcate con proteine fluorescenti. L'analisi è indipendente dalla scelta sonda con una ampia gamma dinamica della densità etichettatura e può quindi essere applicato anche per proteine marcate con punti quantici così come coloranti e proteine fluorescenti come la EGFP.
Pe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da una Lundbeck Junior Capo Gruppo Fellowship a LNN. PWW riconosce il sostegno finanziamenti provenienti scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC). Ringraziamo anche il danese Molecolare Bioimmagini Center presso University of Southern Denmark di accesso a spinning microscopio disco.
Materials
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