קל מדידה של מקדמי דיפוזיה של חלבונים בממברנה פלזמה מתויגים-EGFP באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם תמונת k-Space
Summary
מאמר זה מספק מדריך צעד אחר צעד למתאם טכניקת ניתוח תנודות k-Space תמונת ספקטרוסקופיה (kICS) למדידת מקדמי דיפוזיה של כותרתו fluorescently חלבוני קרום פלזמה בתאי יונקים חיים.
Abstract
דיפוזיה ומידור של חלבוני קרום פלזמה לרוחב מוסדרים בחוזקה בתאים ובכך, לומדות את התהליכים האלה יגלו תובנות חדשות לפונקציה פלזמה קרום חלבון ורגולציה. לאחרונה, מתאם תמונת k-Space ספקטרוסקופיה (kICS) 1 פותח כדי לאפשר מדידות שגרתיות של מקדמי דיפוזיה ישירות מתמונות של חלבוני קרום פלזמה מתויגים פלורסנטי, שנמנעו מהטיות שיטתיות הוצגו על ידי photophysics בדיקה. למרות הבסיס התיאורטי לניתוח הוא מורכב, השיטה יכולה להיות מיושמת על ידי nonexperts באמצעות קוד זמין באופן חופשי למדידת מקדמי דיפוזיה של חלבונים. kICS מחשבת פונקציית מתאם זמן מערימת תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאחר שינוי פורייה של כל תמונה למרחב גומלין (k-). בהמשך לכך, מיצוע מעגלי לוגריתם, טבעי ולהפוך ליניארי מתאים לפונקציית המתאם מניב את מקדם הדיפוזיה. זהנייר מספק מדריך צעד אחר צעד לניתוח התמונה והמדידה של מקדמי דיפוזיה דרך kICS.
ראשית, תמונה ברצף במסגרת שיעור גבוהה של חלבון קרום פלזמה שכותרתו fluorescently נרכש באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לאחר מכן, באזור של עניין (ROI) הימנעות אברונים תאיים, נע שלפוחית או בולטות אזורי קרום נבחר. ערימת ההחזר על ההשקעה מיובאת לקוד זמין באופן חופשי וכמה פרמטרים שהוגדר (ראה סעיף שיטה) נקבעים לניתוח kICS. התכנית לאחר מכן יוצרת "מדרון של מדרונות" עלילה מפונקציות קורלציה זמן k-המרחב, ומקדם הדיפוזיה מחושב מהשיפוע של העלילה. להלן הליך kICS צעד אחר צעד כדי למדוד את מקדם הדיפוזיה של חלבון בממברנה באמצעות תעלת המים aquaporin-3 הכליות מתויגות עם EGFP כדוגמא הקנונית.
Introduction
ארגון ארבעה ממדי החלל ובזמן והניידות לרוחב של חלבוני קרום פלזמה בחוזקה מוסדרות ועשויים לשחק תפקיד בתפקוד חלבון, פעילות ואינטראקציות בין חלבונים. דיפוזיה רוחבית של חלבוני קרום פלזמה, באופן מסורתי נחקרה על ידי חישוב מקדמי דיפוזיה עבור חלקיקים בודדים מהזמן לשגות הדמיה של נקודה קוונטית או לצבוע את חלבוני קרום הפלזמה שכותרתו 2-4. גישה זו דורשת החדרת תג תאי בחלבון הפלזמה הממברנה לנקודה קוונטית או תיוג צבע, אשר יכול לסכן את קיפול חלבונים ותפקוד ובכך, לא ניתן להשיג עבור חלק מחלבונים. הנפח הסטרי של נקודה קוונטית הוכח להאט דיפוזיה של החלבון 5 ויותר מכך, רק חלק זעיר של החלבונים באוכלוסייה מסומנים עם נקודות קוונטיות, וזה לא ידוע אם חלק קטן הזה הוא נציג לסך בריכה של חלבוני קרום פלזמה. טרה חלקיק יחידהמדידות cking (SPT) של מקדמי דיפוזיה סדרת תמונה של חלבוני שכותרת נקודה קוונטית מכרוכות במיפוי עמדות שיא הדמיה של חלקיקים עם שני גאוס ממדי מתאים אחרי אלגוריתמי ניתוח נרחבים. הניתוח הוא המחשוב מאוד אינטנסיבי, הדורש עקומה שאינה ליניארי נרחב הולמת בכל מסגרת תמונה של רצף הזמן לשגות לקירובים של פונקצית התפשטות נקודת מיקרוסקופ (בדרך כלל שני Gaussians מרחבי ממדי) וקישור הבא של עמדות חלקיקים למסלולי חלקיקים המתאר את תנועה של מולקולות בודדות 6,7.
טכניקת מתאם תמונה שפותחה לאחרונה, מתאם תמונת k-Space ספקטרוסקופיה (kICS) מאפשרת מדידות פשוטות היחסית של מקדמי דיפוזיה של חלבונים מתויגים fluorescently קרום פלזמה. האפשרות לחשב באופן שגרתי מקדמי דיפוזיה של חלבונים בממברנה שכותרתו עם חלבוני ניאון על ידי kICS היא כלי ייחודי המחזיקמספר יתרונות על פני קוונטים מסורתיים מנקדים ניתוח SPT: אין כניסה של תגים תאיים וזמן רב תיוג תאי נדרש (ניתן להשתמש בשורות תאים לבטא חלבוני ניאון); מקדמי דיפוזיה מופקים מכלל המאגר של חלבוני ניאון בהשוואה לקבוצת משנה שכותרתו עם נקודות קוונטיות; הניתוח הוא פשוט ללא הצורך לעקוב אחר חלבונים יחיד והניתוח יכול להתבצע באמצעות קוד קיים, ללא צורך בתכנות משתמש נוסף. השיטה היא מהירה כי זה טכניקת מיצוע המאפשרת חישוב וחישוב מהירים של מקדמי דיפוזיה. מדידות דיפוזיה המהירה אלה לאוכלוסיית החלבון משלימות את מידע תחבורה המולקולרי מפורט יותר שהושג לקבוצת משנה של כלל האוכלוסייה על ידי שיטות SPT מדקדק.
זמן kICS קורלציה רצפי תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי שראשון הפכו למקום פורייה, ובכך מפריד flתנודות uorescence עקב photophysics מאלו כתוצאה מההובלה מולקולרית 1. כתוצאה מכך, kICS יכול לקבוע את צפיפות המספר, מהירות זרימה, ודיפוזיה של כותרתו fluorescently מולקולות בעת היותו בלתי משוחד על ידי photobleaching המורכב או מהבהב של fluorophores. זה עושה kICS כלי שימושי לקביעת מהירות דינמיקת דיפוזיה של חלבוני קרום תא fluorescently שהכותרת ללא הצורך בכתיבת האלגוריתמים מותאמים אישית. חלבונים חוץ מכותרתו fluorescently, יכול להיות מיושמים גם kICS לחלבוני קרום קוונטים שכותרת נקודה 8.
מאמר זה מספק מבוא צעד אחר הצעד כיצד להשתמש kICS לחלץ מקדמי דיפוזיה של חלבוני קרום פלזמה מתויגים-EGFP ידי המדגים כיצד למקם את היבול, את אופן השימוש בקוד וכיצד להעריך את החלקות שנוצרו, שממנו דיפוזיה מקדמים מחולצים. כדוגמא, נתונים המתקבלים על ידי ספינינג סט דיסק מיקרוסקופיה בהשתקפות פנימית למחצה כוללת לזרוחמצב NCE (TIRF), של חלבון תעלת המים aquaporin-3 כליות (AQP3) מתויגים עם EGFP מוצג.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה הציג סקירת צעד אחר צעד מפורטת של איך ליישם את שיטת ניתוח kICS לקבוע מקדמי דיפוזיה מתמונות מיקרוסקופית של חלבונים מתויגים עם חלבוני ניאון. הניתוח אינו תלוי בבחירת בדיקה עם טווח דינמי רחב מאוד בצפיפות תיוג ולכן יכול להיות מיושם גם לחלבונים שכותרתו עם נקודות קוונ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מלגה לונדבק Junior קבוצת לידר לLNN. PWW מכיר בתמיכה במימון מענק ממדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה (NSERC). אנו מודים גם מולקולרי מרכז bioimaging הדנית באוניברסיטת דרום דנמרק לגישה לספינינג מיקרוסקופ דיסק.
Materials
Referências
- Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics. Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).
- Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots. Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
- Pinaud, F., et al. Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking. Traffic. 10, 691-712 (2009).
- Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations. Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).
- Durisic, N., et al. Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules. Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).
- Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera. Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).
- Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus. The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).
- Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys J. 92, 613-621 (2007).
- Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).
- Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Løcke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion. Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).
