Facile mesure de coefficients de diffusion de EGFP-marqués plasma protéines membranaires en utilisant K-image de l'espace spectroscopie de corrélation
Summary
Ce document fournit un guide étape par étape pour la technique d'analyse de fluctuation k-image de l'espace spectroscopie de corrélation (CCI) pour mesurer les coefficients de diffusion des protéines marquées par fluorescence de la membrane plasmique des cellules de mammifères vivants.
Abstract
Diffusion latérale et la compartimentation des protéines de la membrane plasmique sont strictement réglementées dans les cellules et donc, l'étude de ces processus va révéler de nouvelles perspectives à plasma fonction de la protéine de la membrane et de la réglementation. Récemment, k-image de l'espace spectroscopie par corrélation (CCI) 1 a été développé pour permettre des mesures de routine de coefficients de diffusion directement à partir des images des protéines de la membrane plasmique marquées par fluorescence, qui ont évité les biais systématiques introduites par photophysique de la sonde. Bien que la base théorique pour l'analyse est complexe, le procédé peut être mis en oeuvre par des non experts en utilisant un code librement disponible pour mesurer les coefficients de diffusion des protéines. CIEk calcule une fonction de corrélation temporelle d'une image de microscopie à fluorescence pile après transformation de Fourier de chaque image pour réciproque (k-) espace. Par la suite, une moyenne circulaire, logarithme naturel transformée linéaire et correspond à la fonction de corrélation donne le coefficient de diffusion. Cedocument fournit un guide étape par étape pour l'analyse d'image et la mesure des coefficients de diffusion via CIEk.
D'abord, une image d'une séquence de protéines de membrane de plasma marqué par fluorescence de cadence élevée est acquise en utilisant un microscope à fluorescence. Puis, une région d'intérêt (ROI) en évitant organites intracellulaires, les vésicules se déplaçant ou en saillie régions de la membrane est sélectionné. La pile de retour sur investissement est importé dans un code librement disponible et plusieurs paramètres définis (voir la section Méthode) sont définis pour l'analyse des CCI. Le programme génère alors une «pente des pentes« complot des fonctions de corrélation de temps k-espace, et le coefficient de diffusion est calculée à partir de la pente de la courbe. Voici une procédure étape par étape CIEk pour mesurer le coefficient de diffusion d'une protéine de membrane à l'aide du rénale canal d'eau aquaporine-3 marqués avec EGFP comme un exemple canonique.
Introduction
L'organisation spatio-temporelle quatre dimensions et la mobilité latérale des protéines membranaires plasmatiques sont strictement réglementées et peuvent jouer un rôle dans la fonction de la protéine, l'activité et les interactions protéine-protéine. Diffusion latérale des protéines de la membrane de plasma, a traditionnellement été étudiée en calculant les coefficients de diffusion pour les particules individuelles à partir de l'imagerie time-lapse de point quantique ou un colorant des protéines marquées de la membrane plasmique 2-4. Cette approche nécessite l'insertion d'une étiquette extracellulaire dans le plasma protéine membranaire de point quantique ou un marquage par un colorant, qui peut compromettre le pliage et la fonction des protéines et, par conséquent, ne peut être réalisé pour certaines protéines. Le volume stérique d'un point quantique a été montré pour ralentir la diffusion de la protéine 5 et plus, seule une infime fraction des protéines de la population sont étiquetés avec des points quantiques, et on ne sait pas si cette fraction est représentatif pour l'ensemble de un groupe de protéines de membrane de plasma. Tra de particules simplescking (SPT) des mesures de coefficients de diffusion de la série d'image de protéines marquées de points quantiques consiste à cartographier les positions des pics de représentation des particules avec deux dimensions gaussien Convient suivis par de vastes algorithmes d'analyse. L'analyse est de calcul très intense, ce qui nécessite de courbe non linéaire étendu raccord à chaque trame d'image d'une séquence time-lapse à des approximations de la fonction microscope d'étalement de point (typiquement deux dimensions gaussiennes spatiale) et la liaison subséquente des positions des particules dans les trajectoires des particules décrivant l' mouvement des molécules simples 6,7.
Une technique de corrélation d'images récemment mis au point, k-image de l'espace spectroscopie de corrélation (CCI) permet des mesures relativement simples de coefficients de diffusion de fluorescence protéines marquées de la membrane plasmique. La possibilité de calculer systématiquement les coefficients de diffusion des protéines membranaires avec des protéines fluorescentes marquées par CIEk est un outil unique qui maintientplusieurs avantages par rapport quantique traditionnelle dot analyse SPT: Aucune insertion de balises et temps extracellulaires consommateurs étiquetage extracellulaire est nécessaire (lignées de cellules exprimant des protéines fluorescentes peuvent être utilisés); les coefficients de diffusion sont extraites à partir du pool total de protéines fluorescentes par rapport à un sous-ensemble marqué avec des points quantiques; analyse est simple, sans la nécessité de suivre certaines protéines et l'analyse peut être effectuée en utilisant un code existant sans nécessiter de programmation supplémentaire de l'utilisateur. La méthode est rapide car il s'agit d'une technique de calcul de moyenne, qui permet un calcul rapide et le calcul des coefficients de diffusion. Ces mesures de diffusion rapide de la population en protéines complètent l'information de transport moléculaire plus détaillée obtenue pour un sous-ensemble de la population par les méthodes SPT laborieux.
temps CIEk corrélation microscopie de fluorescence des séquences d'images qui ont d'abord été transformées à l'espace de Fourier, et ainsi sépare flfluctuations uorescence raison de photophysique de celles dues au transport moléculaire 1. En conséquence, les CCI peuvent déterminer la densité en nombre, de la vitesse d'écoulement, et la diffusion des molécules marquées par fluorescence tout en étant biaisée par photoblanchiment complexe ou le clignotement des fluorophores. Cela rend CIEk un outil utile pour déterminer rapidement la dynamique de diffusion de protéines membranaires de cellules marquées par fluorescence, sans la nécessité d'algorithmes d'écriture personnalisées. En plus des protéines marquées par fluorescence, CIEk peuvent également être appliquées à des protéines de membrane quantiques point marqué 8.
Cet article fournit une introduction étape par étape comment utiliser CIEk pour extraire les coefficients de diffusion des protéines de la membrane plasmique EGFP-marqués en démontrant comment placer la culture, comment utiliser le code et comment évaluer les tracés générés, dont la diffusion les coefficients sont extraits. A titre d'exemple, les données obtenues par filage ensemble disque-microscopie en réflexion totale interne semi-fluorescenceMode nce (FRBR), d'une protéine canal rénale de l'eau aquaporine-3 (AQP3) étiqueté avec EGFP est présenté.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce document présente un aperçu détaillé étape par étape de la façon d'appliquer la méthode d'analyse des CIEk pour déterminer les coefficients de diffusion à partir d'images de microscopie de protéines marquées avec des protéines fluorescentes. L'analyse est indépendant du choix de la sonde avec une très large gamme dynamique de la densité de marquage et peut donc également être appliquée à des protéines marquées avec des points quantiques ainsi que des colorants et des protéines f…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une Lundbeck Junior Group Leader Bourse de LNN. PWW reconnaît le soutien financier de la subvention du Conseil de recherches en génie du Canada (CRSNG) en sciences naturelles et. Nous remercions également le danois moléculaire Bioimaging Centre à l'Université du Danemark du Sud pour l'accès à la filature microscopie disque.
Materials
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