K-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi kullanarak EGFP-etiketli Plazma Membran Proteinleri Difüzyon Katsayılarının kolay Ölçümü
Summary
Bu kağıt floresan canlı memeli hücrelerinde plazma zarı proteinleri etiketli difüzyon katsayılarını ölçmek için dalgalanma analizi tekniği k-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi (kICS) için adım kılavuz bir adım sağlar.
Abstract
Yanal difüzyon ve plazma membran proteinlerinin kompartmentalizasyonunun sıkı hücrelerinde düzenlenir ve bu nedenle, bu süreçleri inceleyerek plazma membran proteini fonksiyonu ve regülasyonu için yeni anlayışlar ortaya çıkaracaktır. Son zamanlarda, k-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi (kICS) 1 doğrudan prob fotofizikten tarafından tanıtıldı sistematik önyargıları kaçınılması floresan etiketli plazma zarı proteinlerinin görüntüleri, gelen difüzyon katsayılarının rutin ölçümler sağlamak için geliştirilmiştir. Analiz için teorik temel karmaşık olsa da, bu yöntem proteinlerin difüzyon katsayıları ölçmek için bir kodu kullanarak serbestçe kullanılabilir nonexperts ile uygulanabilir. kICS karşılıklı (k-) alan her görüntünün Fourier dönüşümünden sonra bir floresan mikroskopi görüntü yığınından bir zaman korelasyon işlevi hesaplar. Daha sonra, dairesel ortalama, doğal logaritma dönüşümü ve doğrusal verir korelasyon fonksiyonuna difüzyon katsayısı uyuyor. BuKağıt kICS üzerinden görüntü analizi ve difüzyon katsayılarının ölçümü için bir adım-adım kılavuz sağlar.
İlk olarak, bir floresan etiketli plazma zar proteini yüksek çerçeve hızlı görüntü dizisi, bir floresans mikroskobu kullanılarak elde edilir. Daha sonra, ilgi (ROI) membran bölgeleri, hücre içi organelleri kaçınarak veziküllerini hareketli veya çıkıntılı bir bölge seçilir. ROI yığını bir serbestçe kullanılabilir koduna ithal edilir ve birkaç tanımlanmış parametreler (Yöntem bölümüne bakınız) kICS analiz için ayarlanır. Program daha sonra k-uzay zaman korelasyon fonksiyonlarından komplo bir "yamaçlarında yamaç" oluşturur ve difüzyon katsayısı arsa eğiminden hesaplanır. Aşağıda bir örnek olarak, bir kanonik EGFP ile etiketlendi renal su kanalı aquaporin-3 ile, bir membran proteini difüzyon katsayısı ölçmek için bir adım adım kICS işlemdir.
Introduction
Plazma zar proteinlerinin dört boyutlu uzaysal Organizasyon ve yanal hareket sıkı bir şekilde düzenlenmiş ve protein fonksiyonu, aktivite ve protein-protein etkileşimleri, bir rol oynayabilir. Plazma zarı proteinlerinin yanal difüzyon, geleneksel kuantum nokta time-lapse görüntüleme gelen tek parçacıklar için difüzyon katsayılarını hesaplayarak veya etiketli plazma zarı proteinleri 2-4 boya tarafından incelenmiştir. Bu yaklaşım, protein katlanmasına ve işlevini olumsuz etkileyebilir ve bu nedenle, bazı proteinler için elde edilemez kuantum nokta ya da boya etiketleme için plazma zar proteini, bir hücre dışı etiketi sokulmasını gerektirir. Kuantum nokta sterik hacmi, proteinin 5 difüzyonunu yavaşlatmak için ve ayrıca, popülasyondaki proteinlerin sadece çok küçük bir bölümü kuantum noktaları ile etiketlenir gösterilmiştir, ve bu fraksiyon toplam temsili ise bilinmemektedir plazma zarı proteinlerinin havuzu. Tek parçacık trakuantum dot etiketli proteinlerin görüntü dizisinden difüzyon katsayıları cking (SPT) ölçümleri haritalayan iki boyutlu Gauss olan parçacıkların görüntülenmiş zirve pozisyonları kapsamlı analizi algoritmaları ardından uyar içerir. Analiz açıklayan parçacık yörüngeleri içine mikroskop nokta dağılım fonksiyonu (genellikle iki boyutlu uzamsal Gauss) ve partikül pozisyonları sonraki bağlayan yaklaşımları bir time-lapse dizisi her resim çerçevesi uydurma geniş doğrusal olmayan eğri gerektiren hesaplama çok yoğun tek moleküllerin 6,7 hareketi.
Yakın zamanda geliştirilen görüntü korelasyonu tekniği, k-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi (kICS) floresan plazma zarı etiketli proteinlerin difüzyon katsayılarının göreceli basit ölçümler sağlar. Rutin kICS tarafından floresan proteinleri ile etiketlenmiş membran proteinlerinin difüzyon katsayılarını hesaplamak için olasılık tutan benzersiz bir araçtırGeleneksel kuantum üzerinde çeşitli avantajları SPT analizi dot: hücre dışı etiketleme alıcı dışı etiketleri ve zaman hiçbir ekleme (floresan proteinleri ifade hücre hatları kullanılabilir) gereklidir; difüzyon katsayıları kuantum noktaları ile etiketlenmiş bir alt ile karşılaştırıldığında floresan proteinlerin toplam miktarından çıkarılır; Analiz tek proteinler izlemek için gerek olmadan basit ve analiz ek kullanıcı programlanması için bir şartı ile olan bir kodu kullanarak gerçekleştirilebilir. Difüzyon katsayılarının hızlı hesaplama ve hesaplamayı sağlayan bir ortalama tekniktir çünkü yöntem hızlıdır. Protein nüfusun bu hızlı difüzyon ölçümleri özenli SPT yöntemlerle nüfusun bir alt kümesi için elde daha ayrıntılı moleküler taşıma bilgileri tamamlar.
kICS sefer ilk Fourier uzayında dönüştürülmüştür floresan mikroskobu görüntü dizileri ilişkilidir ve böylece fl ayırırMoleküler ulaşım 1 dolayı olanlardan fotofizikten nedeniyle uorescence dalgalanmalar. Sonuç olarak, kICS, sayı yoğunluğu belirlemek akış hızı ve kompleks ışıkla ağartma ile ilgili olan ya da florofor yanıp sönen difüzyon floresan etiketli moleküller olabilir. Bu, hızlı bir şekilde özel kICS yazma algoritmalar için gerek kalmadan floresan etiketli hücre zarı proteinlerinin difüzyon dinamiklerinin belirlenmesi için uygun bir araç sağlar. Bunun yanı sıra floresan etiketli proteinler, kICS da kuantum dot-işaretli zar proteinleri 8 uygulanabilir.
Bu kağıt kodu ve nasıl oluşturulan araziler, değerlendirmek için nasıl kullanılacağını, kırpma yerleştirmek için nasıl göstererek EGFP-etiketli plazma membran proteinlerinin difüzyon katsayıları ayıklamak için kICS kullanmak için nasıl bir adım-adım giriş sağlayan difüzyon itibaren katsayıları ayıklanır. Bir örnek olarak, yarı toplam iç yansıma disk mikroskopi dizi eğirme ile elde edilen veriler floresanEGFP'nin ile etiketlenmiş bir böbrek su kanalı proteini aquaporin-3 (AQP3) ve nce (TIRF) modu, sunulmuştur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu kağıt floresan proteinleri ile etiketli proteinlerin mikroskopi görüntüleri difüzyon katsayıları belirlemek için kICS analiz yöntemi uygulamak için nasıl ayrıntılı adım-adım bir bakış sundu. Analiz etiketleme yoğunluğunda çok geniş bir dinamik aralık ile prob seçimi bağımsızdır ve bu yüzden aynı zamanda Kuantum noktalarının yanısıra boyalar ve EGFP gibi floresan proteinleri ile etiketlenmiş proteinleri uygulanabilir.
Proteinler için geçerli difüzyon …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Han'a bir Lundbeck Gençler Grubu Lideri Bursu ile desteklenmiştir. PWW Doğa Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) hibe fon desteği kabul eder. Biz Ayrıca disk mikroskobu iplik erişim için Güney Danimarka Üniversitesi Danimarkalı Moleküler Biyogörüntüleme Merkezi'ni teşekkür ederim.
Materials
Referências
- Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics. Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).
- Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots. Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
- Pinaud, F., et al. Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking. Traffic. 10, 691-712 (2009).
- Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations. Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).
- Durisic, N., et al. Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules. Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).
- Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera. Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).
- Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus. The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).
- Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys J. 92, 613-621 (2007).
- Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).
- Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Løcke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion. Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).
