Einfache Messung des Diffusionskoeffizienten von EGFP-markierten Plasmamembranproteine Mit k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie
Summary
Dieses Papier bietet eine Schritt für Schritt Anleitung, um die Fluktuationsanalyse-Technik k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie (KIC) zur Messung der Diffusionskoeffizienten von fluoreszenz in lebenden Säugerzellen gekennzeichnet Plasmamembranproteinen.
Abstract
Lateral Diffusion und Kompartimentierung der Plasmamembran-Proteine sind fest in Zellen reguliert und damit das Studium dieser Prozesse werden neue Erkenntnisse zur Plasmamembran-Protein-Funktion und Regulation offenbaren. Kürzlich, k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie (KIC) wurde entwickelt, um ein Routine-Messungen der Diffusionskoeffizienten direkt aus Bildern von fluoreszierend markierten Plasmamembran-Proteine, die von Photophysik Sonde eingeführt systematischer Fehler vermieden zu ermöglichen. Obwohl die theoretische Grundlage für die Analyse kompliziert ist, kann das Verfahren durch Nicht-Experten unter Verwendung einer frei verfügbaren Code zum Diffusionskoeffizienten von Proteinen messen implementiert werden. KIC berechnet eine Zeitkorrelationsfunktion von einem Fluoreszenzmikroskopie Bildstapel nach Fourier-Transformation jedes Bild, um gegenseitige (k-) Raum. Anschließend Kreismittelung, natürlichen Logarithmus-Transformation und lineare passt zu der Korrelationsfunktion ergibt sich die Diffusionskoeffizienten. DiesPapier bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Bildanalyse und Messung von Diffusionskoeffizienten über KIC.
Zuerst wird eine hohe Bildrate Bildsequenz eines fluoreszierend markierten Plasmamembranprotein mit einem Fluoreszenzmikroskop erfasst. Dann wird ein Bereich von Interesse (ROI) zu vermeiden intrazellulären Organellen, Vesikel bewegt oder hervorMembranBereiche ausgewählt. Die ROI-Stapel in einem frei verfügbaren Code importiert und mehreren definierten Parameter (siehe Abschnitt Methode) sind für die KIC Analyse gesetzt. Das Programm erzeugt dann einen "Hang Pisten" Handlung aus den k-Raum-Zeit-Korrelationsfunktionen und der Diffusionskoeffizient wird aus der Steigung des Grundstücks berechnet. Unten finden Sie eine Schritt-für-Schritt-Verfahren, um die KIC Diffusionskoeffizient eines Membranproteins messen mit der renalen Wasserkanal Aquaporin-3 mit EGFP als kanonische Beispiel verschlagwortet.
Introduction
Die vierdimensionale Raum-Zeit-Organisation und die seitliche Beweglichkeit der Plasmamembran-Proteine sind streng reguliert und können in Protein-Funktion, Aktivität und Protein-Protein-Wechselwirkungen eine Rolle spielen. Die laterale Diffusion von Plasmamembranproteinen, wird traditionell von der Berechnung Diffusionskoeffizienten für Einzelpartikel aus Zeitraffer-Bildgebung von Quantenpunkt-oder Farbstoff markierte Plasmamembran-Proteine 2-4 untersucht. Dieser Ansatz erfordert das Einführen eines extrazellulären Tag in der Plasmamembranprotein für Quantenpunkt oder Farbstoffmarkierung, die die Proteinfaltung und die Funktion beeinträchtigen können und daher nicht für einige Proteine erreicht werden. Die sterische Volumen einer Quantenpunkt ist gezeigt worden, um die Diffusion des Proteins 5 zu verlangsamen und weiterhin nur ein winziger Bruchteil der Proteine in der Bevölkerung mit Quantenpunkten markiert ist, und es ist nicht bekannt, ob diese Fraktion repräsentativ ist für die Gesamt Pool von Plasmamembranproteinen. Einzelpartikel tracking (SPT) Messungen der Diffusionskoeffizienten von Bild-Serie von Quantenpunkt-markierten Proteine beinhaltet Zuordnung der abgebildeten Spitzenpositionen der Partikel mit zweidimensionalen Gauß-Anfälle durch umfangreiche Analysealgorithmen gefolgt. Die Analyse ist sehr rechenintensiv und erfordert umfangreiche nicht-lineare Kurvenanpassung in jedem Einzelbild einer Zeitraffersequenz, um Näherungen der Objektpunktverteilungsfunktion (typischerweise zweidimensionale räumliche Gauß) und anschließender Verknüpfung der Partikelpositionen in Trajektorien beschreiben die Bewegung einzelner Moleküle 6,7.
Eine kürzlich entwickelte Bildkorrelationsverfahren, k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie (KIC) ermöglicht relativ einfachen Messungen der Diffusionskoeffizienten von fluoreszenzmarkierten Plasmamembranproteinen. Die Möglichkeit, routinemäßig berechnen Diffusionskoeffizienten von Membranproteinen mit fluoreszierenden Proteinen markiert durch KIC ist ein einzigartiges Werkzeug, das hältmehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Quantenpunkt SPT Analyse: Keine Insertion von extrazellulärem Tags und zeitaufwendig extrazelluläre Markierung erforderlich ist (Zelllinien, die fluoreszierende Proteine verwendet werden können); Diffusionskoeffizienten aus dem Gesamtpool von fluoreszierenden Proteinen im Vergleich zu einer Teilmenge mit Quantenpunkten markiert extrahiert; Analyse ohne die Notwendigkeit, einzelne Proteine verfolgt einfach und die Analyse kann unter Verwendung einer vorhandenen Code ohne Erfordernis zusätzlicher Anwenderprogrammierung durchgeführt werden. Das Verfahren ist schnell, da es eine Mittelungstechnik, die eine schnelle Berechnung und die Berechnung der Diffusionskoeffizienten ermöglicht. Diese schnellen Diffusionsmessungen für das Protein Bevölkerung ergänzen die detaillierte Informationen molekularen Transport durch die sorgfältige SPT Methoden für eine Teilmenge der Bevölkerung erhalten.
KIC Zeit korreliert Fluoreszenzmikroskopie Bildfolgen, die als erste Fourierraum transformiert worden sind, und dadurch trennt fluorescence Schwankungen durch Photophysik von den zur molekularen Transport ein. Als Ergebnis kann die Anzahl KIC Dichte zu bestimmen, Durchflussgeschwindigkeit und Diffusion von fluoreszenzmarkierten Molekülen während unvoreingenommene durch komplexe Photobleichen oder blinkt der Fluorophore. Dies macht KIC ein nützliches Werkzeug für die schnelle Bestimmung der Diffusionsdynamik des fluoreszenzmarkierten Zellmembranproteinen, ohne dass individuelle Schreib Algorithmen. Neben der fluoreszenzmarkierten Proteine, KIC auch auf Quantenpunkt-markierten Membranproteine 8 angewendet werden.
Dieses Papier bietet eine Schritt-für-Schritt-Einführung, wie man KIC verwenden, um Diffusionskoeffizienten von EGFP-markierten Plasmamembran-Proteine durch den Nachweis, wie man die Ernte zu platzieren, wie man den Code und wie man die generierten Plots, auszuwerten extrahieren, aus dem Diffusions Koeffizienten extrahiert. Als Beispiel Daten durch Spinning-Disk-Mikroskopie-Set im internen Halbtotalreflexion erhalten fluoreszierennce (TIRF)-Modus, einer Nieren-Wasser-Kanal-Protein Aquaporin-3 (AQP3) mit EGFP markiert wird vorgestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Papier präsentiert eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Überblick darüber, wie die KIC Analyseverfahren gelten für Diffusionskoeffizienten von Mikroskopiebilder von Proteinen mit fluoreszierenden Proteinen markiert bestimmen. Die Analyse ist unabhängig von der Wahl Sonde mit einem sehr breiten Dynamikbereich bei der Etikettierung Dichte und kann somit auch Proteine mit Quantenpunkten sowie Farbstoffe und fluoreszierende Proteine wie EGFP angewendet werden.
Gültige …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von einem Lundbeck Junior Group Leader-Stipendium für LNN unterstützt. PWW erkennt Zuschussfinanzierung Unterstützung von den Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC). Wir danken auch den dänischen Molekulare Bildgebung in der Biophotonik Center an der University of Southern Denmark für den Zugriff auf Spinning-Disk-Mikroskopie.
Materials
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