Fácil medição de Difusão Coeficiente de EGFP-tag Plasma Proteínas de Membrana Usando k-Space espectroscopia de correlação de Imagem

Summary

Este documento fornece um guia passo a passo para a técnica de análise de flutuação k-Espaço de Correlação Imagem Espectroscopia (CCI) para medir coeficientes de difusão de fluorescente etiquetado proteínas da membrana plasmática em células de mamíferos vivos.

Abstract

Difusão lateral e compartimentalização de proteínas da membrana plasmática são fortemente regulados em células e, assim, estudar esses processos irão revelar novas perspectivas para a função da proteína da membrana plasmática e regulação. Recentemente, k-Espaço de Correlação Imagem Espectroscopia (CCI) ¹ foi desenvolvido para permitir medições de rotina de coeficientes de difusão diretamente a partir de imagens de proteínas da membrana plasmática marcados fluorescente, que evitaram desvios sistemáticos introduzidos pelo fotofísica sonda. Embora a base teórica para a análise é complexo, o método pode ser implementado por não-especialistas, utilizando um código livremente disponível para medir os coeficientes de difusão de proteínas. CCI calcula uma função de correlação de tempo a partir de uma imagem Pilha de microscopia de fluorescência após a transformação de Fourier de cada imagem para (k-) espaço recíproco. Subsequentemente, transformar média circular, logaritmo natural e linear encaixa para a função de correlação obtém-se o coeficiente de difusão. Estedocumento fornece um guia passo-a-passo para a análise de imagem e medição de coeficientes de difusão via CCI.

Primeiro, uma sequência de imagens de alta taxa de quadros de uma proteína da membrana plasmática fluorescente etiquetado é adquirido através de um microscópio de fluorescência. Em seguida, uma região de interesse (ROI) evitando organelas intracelulares, vesículas em movimento ou salientes regiões da membrana é selecionado. A pilha de ROI é importado para um código disponível gratuitamente e vários parâmetros definidos (ver secção Method) são definidos para análise CCI. O programa então gera uma "inclinação das encostas" complô das funções de correlação tempo k-espaço, eo coeficiente de difusão é calculado a partir da inclinação da trama. Abaixo está um procedimento passo-a-passo CCI para medir o coeficiente de difusão de uma proteína de membrana usando o canal de água aquaporina renal-3 marcado com EGFP como um exemplo canônico.

Introduction

A organização espaço-temporal quadridimensional e mobilidade lateral de proteínas da membrana plasmática estão fortemente regulada e pode desempenhar um papel na função da proteína, actividade e interacções proteína-proteína. Difusão lateral de proteínas da membrana plasmática, tradicionalmente tem sido estudada pelo cálculo de coeficientes de difusão para partículas individuais de lapso de tempo de imagem de ponto quântico ou tingir proteínas da membrana plasmática rotulados ^2-4. Esta abordagem requer a inserção de uma etiqueta extracelular da proteína de membrana de plasma para quantum dot ou marcação com corante, o que pode comprometer a dobragem e função da proteína e, assim, não pode ser alcançada por algumas proteínas. O volume estérico de um quantum dot tem mostrado retardar a difusão da proteína de ⁵ e, além disso, apenas uma pequena fracção das proteínas na população são marcadas com pontos de quantum, e não se sabe se esta fracção é representativo para o total associação de proteínas de membrana de plasma. Tra única partículacking (SPT) medições de coeficientes de difusão da série de imagens de proteínas marcadas ponto quântico envolve o mapeamento das posições de pico fotografada das partículas com bidimensional Gaussian encaixa seguido por extensos algoritmos de análise. A análise é computacionalmente muito intensivo, exigindo extensa curva não-linear adequado em cada quadro da imagem de uma seqüência de lapso de tempo para aproximações da função microscópio ponto spread (tipicamente bidimensional Gaussians espacial) e vinculação posterior de posições de partículas em trajetórias de partículas descrevendo o movimento de moléculas individuais ^6,7.

A técnica de correlação de imagem recentemente desenvolvido, k-Espaço de Correlação Imagem Espectroscopia (CCI) permite medições simples relativos dos coeficientes de difusão de fluorescente etiquetado proteínas da membrana plasmática. A possibilidade de calcular rotineiramente coeficientes de difusão de proteínas da membrana marcados com proteínas fluorescentes por CCI é uma ferramenta única que detémvárias vantagens sobre quantum dot análise tradicional SPT: Sem inserção de marcas e consumindo tempo extracelulares rotulagem extracelular é necessária (linhas de células que expressam proteínas fluorescentes podem ser usados); coeficientes de difusão são extraídos a partir do conjunto total de proteínas fluorescentes em relação a um subconjunto marcado com pontos quânticos; A análise é simples, sem a necessidade de controlar as proteínas individuais e a análise pode ser realizada utilizando um código existente sem a necessidade de programação de utilizador adicionais. O método é rápido, porque é uma técnica de cálculo da média, que permite o cálculo rápido e cálculo dos coeficientes de difusão. Estas medições rápida difusão para a população de proteína complementar as informações de transporte molecular mais detalhada obtida para um subconjunto da população pelos métodos SPT meticuloso.

tempo CCI correlaciona sequências de imagens de microscopia de fluorescência, que tenham sido previamente transformadas com o espaço de Fourier, e assim separa flflutuações uorescência devido a fotofísica daqueles devido ao transporte molecular ^1. Como resultado, a CCI pode determinar o número de densidade, velocidade de fluxo e difusão de moléculas fluorescente etiquetado sendo imparcial por fotodegradação complexo ou intermitente dos fluoróforos. Isso faz com que CCI uma ferramenta útil para determinar rapidamente a dinâmica de difusão de proteínas de membrana de células marcadas com fluorescência, sem a necessidade de algoritmos de gravação personalizados. Além de proteínas marcadas com fluorescência, CCI também pode ser aplicado a proteínas de membrana marcado com quantum dot ^8.

Este documento oferece uma introdução passo-a-passo de como usar o CCI para extrair coeficientes de difusão de proteínas da membrana plasmática EGFP-marcadas, demonstrando como colocar a cultura, como usar o código e como avaliar as parcelas geradas, a partir do qual a difusão coeficientes são extraídos. Como exemplo, os dados obtidos por fiação conjunto disk-microscopia em reflexão interna semi-total de fluorescênciamodo nce (TIRF), de um renal proteína canal de água aquaporina-3 (AQP3) etiquetadas com EGFP é apresentado.

Protocol

Aquisição de proteínas marcadas com EGFP da membrana do plasma para análise CCI pode ser feito num microscópio de epifluorescência, uma configuração TIRF ou num microscópio de disco giratório definido para adquirir imagens da membrana de interesse. O tamanho do pixel de câmara, assim como o tempo entre os quadros de imagem é necessária para a análise. Sequências de imagens de 100-1,200 quadros em uma taxa de quadros de 4-30 Hz pode ser usado para a análise. Durante a aquisição, é importante para mante…

Representative Results

Para adquirir pilhas de imagens adequadas a serem analisados ​​com CCI, podem ser utilizados diferentes sistemas de microscópio. É possível analisar sequências de imagens de um microscópio de epi-fluorescência, bem como uma configuração de disco TIRF ou spinning. A membrana deve ser plana, sem grandes organelas celulares em movimento ou em movimento vesículas / objetos. Este trabalho apresenta uma seqüência de imagens de lapso de tempo de AQP3 marcadas com GFP em células MDCK ao vivo de imagens em um mic…

Discussion

Este artigo apresentou um panorama detalhado passo-a-passo de como aplicar o método de análise de CCI para determinar coeficientes de difusão de imagens de microscopia de proteínas marcadas com proteínas fluorescentes. A análise é independente da escolha da sonda com uma gama dinâmica muito ampla na densidade rotulagem e pode assim ser também aplicado a proteínas marcadas com pontos quânticos, bem como corantes e proteínas fluorescentes, tais como a EGFP.

Para calcular os coefici…

Materials

DMEM	Gibco	31600-083
FBS	Invitrogen	10082147
Penicilin	Sigma	13752
Kanamycin	Gibco	15160070
Streptomycin	Gibco	11860038
Phenol red free medium	Gibco	11880-028
DMSO	Sigma	D8418
HEPES	Gibco	15630056
Apparatus
Spinning Disk Microscope	Nikon	Ti Eclipse
EMCCD Camera	Andor	Ixon+