Легко Измерение коэффициентов диффузии в EGFP-меченых белков плазматической мембраны Использование К-пространство изображения корреляционной спектроскопии
Summary
Эта статья предоставляет пошаговое руководство к технике анализа колебания к-пространственной корреляции изображения спектроскопии (Kics) для измерения коэффициентов диффузии из флуоресцентно меченных плазмы мембранных белков в живых клетках млекопитающих.
Abstract
Боковая диффузия и компартментализация плазменных мембранных белков жестко регулируется в клетках и, таким образом, изучая эти процессы покажет новое понимание плазмы функции белка мембраны и регулирования. Недавно, к-пространственной корреляции изображения спектроскопия (Kics) 1 был разработан для того, чтобы обычные измерения коэффициентов диффузии непосредственно из образов флуоресцентно меченых белков плазматической мембраны, что избежать систематических ошибок, вносимых зонда фотофизики. Хотя теоретической основой для анализа является сложным, способ может быть реализован с использованием неспециалистов свободном доступе код для измерения коэффициентов диффузии белков. Kics вычисляет время корреляционной функции из стека изображений флуоресцентной микроскопии после преобразования Фурье каждого изображения на обратной (к-) пространстве. Впоследствии, круговая усреднение, натуральный логарифм преобразования и линейная подходит для корреляционной функции дает коэффициент диффузии. Этодокумент содержит шаг за шагом руководство по анализу изображений и измерения коэффициентов диффузии через Kics.
Во-первых, высокая частота кадров последовательность образ дневно с надписью плазмы мембранного белка приобретается с помощью флуоресцентного микроскопа. Затем выбирается область интереса (ROI) избегая внутриклеточных органелл, двигаясь пузырьки или выступающие мембранные регионы. Стек ROI импортируется в свободном доступе кода и несколько определенных параметров (см. раздел Method) установлены для анализа Kics. Затем программа создает "крутизны склонов" заговора от К-пространстве времени корреляционных функций, а коэффициент диффузии рассчитывается по наклону участка. Ниже шаг за шагом Kics процедура измерения коэффициента диффузии мембранных белков с помощью почечной воды канала аквапорин-3 с меткой EGFP как канонический пример.
Introduction
Четырехмерной пространственно-временной организации и боковая подвижность плазмы мембранных белков жестко регулируется и может играть роль в функции белка, активности и белок-белковых взаимодействий. Боковая диффузия плазмы мембранных белков, традиционно изучались путем расчета коэффициентов диффузии для одиночных частиц от покадровой визуализации квантовой точки или красителя меченых белков плазматической мембраны 2-4. Этот подход требует вставку внеклеточного тега в плазматической мембране белка для квантовой точки или маркировки красителем, который может поставить под угрозу складывание и функции белков и, таким образом, не может быть достигнуто в течение нескольких белков. Стерическое объем квантовой точки, как было показано замедлить диффузию белка 5 и более того, лишь малая часть из белков в популяции помечены с квантовыми точками, и это не известно, если эта доля является репрезентативной для общей бассейн плазменных мембранных белков. Холост тра частицCking (СПТ) измерения коэффициентов диффузии из серии изображений на квантовых точках меченых белков включает в себя отображение отображаемого пиковые положения частиц с двумерной гауссовой подходит с последующим обильным алгоритмов анализа. Анализ вычислительно очень интенсивно, требуются обширные нелинейную кривую установки в каждом изображении кадра последовательности покадровой для приближений функции рассеяния точки микроскоп (обычно Двухмерный пространственный гауссианов) и последующего сшивания позиций частиц в траекторий частиц, описывающая движение отдельных молекул 6,7.
Недавно был разработан корреляция техника изображения, к-пространственной корреляции изображения спектроскопия (Kics) позволяет относительные простые измерения коэффициентов диффузии флюоресцентно тегом плазменные мембранные белки. Возможность регулярно расчета коэффициентов диффузии мембранных белков, меченных флуоресцентными белками на Kics является уникальным инструментом, который держитнесколько преимуществ по сравнению с традиционными квантовой точки анализ SPT: Нет вставки внеклеточных тегов и трудоемким внеклеточный маркировки не требуется (можно использовать клеточные линии, экспрессирующие флуоресцентные белки); Коэффициенты диффузии извлекаются из общего пула флуоресцирующих белков по сравнению с подмножеством меченного с квантовыми точками; анализ просто без необходимости отслеживания одиночные белки и анализ может быть проведен с использованием существующего кода без каких-либо необходимых дополнительных пользовательского программирования. Метод быстрый, потому что это техника усреднения, который позволяет быстро вычисление и расчет коэффициентов диффузии. Эти быстрые измерения диффузии для населения белка дополнить более подробную информацию молекулярную транспортного полученное для подмножества населения по кропотливых методов ППП.
Kics время коррелирует флуоресцентной микроскопии последовательности изображений, которые сначала были трансформированы в космос Фурье, и тем самым отделяет этколебания uorescence из-за фотофизики от тех, из-за молекулярного транспорта 1. В результате Kics может определить плотность номер, скорость потока и диффузии флуоресцентно меченных молекул, будучи беспристрастным комплексным фотообесцвечивания или мерцание флуорофоров. Это делает Kics полезный инструмент для быстрого определения динамики диффузии флуоресцентно меченных белков клеточной мембраны без необходимости пользовательских алгоритмов записи. Кроме того флуоресцентно меченых белков, Kics также может быть применен к квантовых точек меченных белков мембраны 8.
Эта статья предоставляет шаг за шагом введение, как использовать Kics извлечь коэффициентов диффузии EGFP-меченых белков плазматической мембраны, демонстрируя, как поместить урожай, как использовать код и как оценить сформированные участки, из которых диффузия коэффициенты извлекаются. В качестве примера, данные, полученные спиннинг диск-микроскопии набор в полу-полного внутреннего отражения светитьсяРежим сть (TIRF), из почек белка вода канала аквапорин-3 (AQP3) помеченным EGFP представлена.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта статья представила подробную шаг за шагом обзор того, как применять метод анализа Kics определить коэффициенты диффузии от микроскопии изображений белков отмеченных флуоресцентных белков. Анализ не зависит от выбора зонда с очень широким динамическим диапазоном плотности маркиро?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана стипендий Lundbeck Младший лидер группы к LNN. PWW признает поддержку от суммы гранта, естественным наукам и инженерным исследовательского совета Канады (NSERC). Мы также благодарим датскую Молекулярная Bioimaging центр в Университете Южной Дании для доступа к спиннинг диска микроскопии.
Materials
Referências
- Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics. Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).
- Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots. Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
- Pinaud, F., et al. Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking. Traffic. 10, 691-712 (2009).
- Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations. Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).
- Durisic, N., et al. Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules. Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).
- Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera. Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).
- Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus. The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).
- Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys J. 92, 613-621 (2007).
- Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).
- Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Løcke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion. Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).
