Anvendelse af retinsyre hentes osteocytter kulturer fra Primary Mouse Osteoblaster

Summary

Behandling af primære muse osteoblaster med retinsyre producerer en homogen population af forgrenede celler, der bærer morfologiske og molekylære egenskaber af osteocytter. Fremgangsmåden overvinder vanskeligheden ved at opnå og bevare primære osteocytter i kultur og kan være fordelagtigt at undersøge celler afledt fra transgene modeller.

Abstract

Behovet for osteocyt kulturer er velkendt for samfundet i knogle forskere; isolering af primære osteocytter er vanskelig og medfører lave celleantal. Derfor er den mest udbredte cellulært system er osteocyt-lignende MLO-Y4 cellelinie.

Fremgangsmåden beskrevet her henviser til brugen af ​​retinsyre til at generere en homogen population af forgrenede celler med morfologiske og molekylære osteocyt funktioner.

Efter isolering af osteoblaster fra mus calvaria er all-trans retinoid syre (ATRA) tilsat til celle medium, og celle kontrollen udføres dagligt under et inverteret mikroskop. Første morfologiske ændringer kan påvises efter 2 dages behandling og differentiering er i almindelighed fuldstændig i 5 dage, med den gradvise udvikling af dendritter, tab af evnen til at producere ekstracellulære matrix, nedregulering af osteoblast markører og opregulering af osteocyt-specifikke molekyler.

indhold "> er nødvendig Daglig overvågning celle på grund af den iboende variabilitet af primærelementer, og protokollen kan tilpasses med minimal variation celler opnået fra forskellige musestammer og anvendes på transgene modeller.

Fremgangsmåden er let at udføre og kræver ikke specielle instrumenter, er meget reproducerbar og hurtigt frembringer et modent osteocyt befolkning i fuldstændigt fravær af ekstracellulær matrix, der tillader anvendelse af disse celler til ubegrænset biologiske anvendelser.

Introduction

Osteocytter, den mest rigelige knogle celletype, er terminalt differentierede, stærkt forgrenede celler dybt placeret inden skelettet. Cellen kroppen af ​​modne osteocytter er indeholdt i knogle mangler og har forskellige former; osteocytter med aflange celle organer findes i barkbenet, mens afrundede osteocytter er hyppigere hos knogletrabecula ^1.. Forgrenede dendritter strækker sig fra cellen kroppen og opholde sig i bittesmå kanaler kaldes canaliculi, danner et indviklet net, der gør flere kontakter, ikke kun med andre osteocytter, men også med andre knogle celletyper, knoglemarv, blodkar og tilhørende pericytes. Gennem interstitielle væske, der er indeholdt i lakuner og canaliculi, osteocytter er også i sidste ende er forbundet til det cirkulerende system, og derfor kan de ikke kun have indflydelse lokale, men også systemiske hændelser, og vice versa deres adfærd kan reguleres af både lokale og systemiske ² ændringer.

Denundersøgelse af osteocytter har for nylig fået momentum, takket være adskillige tekniske fremskridt, såsom generation af vævs-og celle-specifikke transgene dyr, brug af stærke mikroskopi teknikker og af høj-throughput molekylære screening ^3,4. Men viden af disse celler er stadig ufuldstændig, hovedsagelig på grund af den relative knaphed på passende in vitro-modeller. Faktisk har osteocytter altid været vanskeligt at opnå og vedligeholde i kultur på grund af den dybe placering, og det lave niveau af spredning, der kendetegner en sådan differentieret celletype.

Langs år er der blevet udviklet en række metoder til at isolere primære osteocytter ^5-7, selvom de generelt producerer lave celleudbytter og medføre en risiko for, at selv nogle få kontaminerende fibroblaster hurtigt vil overvokse osteocytter ^8. Af denne grund, har mest eksperimenterende in vitro arbejde hidtil blevet gennemført på den veletablerede osteocyt celle line MLO-Y4 ^9.

Yderligere in vitro metoder kan øge muligheden for at studere disse celler og kunne forbedre analysen af osteocyt biologi og patofysiologi. Stort set at blive vedtaget, bør sådanne metoder være let at reproducere, og vil ikke kræve specielle instrumenter eller meget lange gange for at nå cellemodning. Vigtigere er det, hvis det er relevant for primærelementer, ville de gøre det muligt at drage fordel af transgene dyr. Vi har for nylig beskrevet, at behandling af osteoblast cellelinien MC3T3-E1 og primære osteoblaster med retinsyre fremkalder en hurtig ændring fænotype, der fører til udviklingen af en homogen population af forgrenede celler, der bærer morfologiske og molekylære egenskaber af osteocytter ^10.

All-trans-retinoinsyre (ATRA) er en aktiv metabolisk produkt af vitamin A, som regulerer gentransskription ved at binde nukleare retinoinsyrereceptorerne (RAR). RAR'erbinder til DNA som heterodimere med retinoid-X-receptorerne (RXR'er), der førte til modulering af retinsyre (RA)-responsiv målgener ^11. ATRA vist sig at modulere differentiering og modning af flere celletyper, heriblandt andre forgrenede celler, såsom neuronale celler ¹² og podocytes ^13.

Metoden beskrives her, er baseret på tilsætning af ATRA til primære osteoblaster. For at være effektiv, ATRA tilføjes på en præcis modning etape celler udpladet ved en defineret tæthed; i vores erfaring disse forhold er afgørende for at opnå den fænotype skifte fra osteoblaster til osteocytter.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i henhold til de nationale og europæiske gældende regler om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål og blev gennemgået og godkendt af den etiske komité på Milanos universitet. 1.. Isolering af Primære Osteoblaster Metoden med mindre ændringer, følger fremgangsmåden beskrevet af Dodig et al 14. Forbered fordøje medium ved tilsætning af 0,1% collagenase P og…

Representative Results

Resultaterne blev opnået fra 5 til 10 uafhængige forsøg. Cellemorfologi AA / GP behandlede primære celler har det meste brosten-lignende funktioner, karakteristisk af modne osteoblaster. Afbrudt forgrenede celler (som angivet med røde pile i figur 1A) kan findes, som sandsynligvis repræsenterer nogle osteocytter. Med ATRA behandling, celler hurtigt begynde at vise forgreninger, der normalt observeres efter 2 dage. Som…

Discussion

I de seneste år er osteocyt har vist sig som den mest centrale celle i knoglen. Forskning fremskridt gradvis afslører et antal tidligere uventede eller uprøvede osteocyt egenskaber, som er af enorm værdi til at designe nye og bedre behandling for en række af knoglesygdomme. Imidlertid har undersøgelse af osteocyt biologi blevet ramt af den begrænsede tilgængelighed af in vitro-modeller til en sådan grad, at osteoblaster har været anvendt som surrogat celler over en lang periode inden osteocyt cellelin…

Materials

Name	Company	Cat #	comments
Collagenase P	Roche Applied Science	11213857001
Trypsin	Gibco, Life Technologies	15400054
HBSS	Gibco, Life Technologies	14175129	Pre-warm at 37°C before use
Alpha-MEM	Invitrogen, Life Technologies	22571038	Pre-warm at 37°C before use
FBS	Sigma-Aldrich	F4135
Streptomycin/Penicillin	Sigma-Aldrich	P4333
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403
glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422
ATRA	Sigma-Aldrich	R2625	Protect ATRA from light
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Dissolve in PBS and filter before use. Work always under a chemical hood.
DAPI	Sigma-Aldrich	32670	Can be added to the secondary antibody
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A5533
Janus Green	Sigma-Aldrich	201677
Perchloric acid	Sigma-Aldrich	176745	Use with caution (skin and eye protection are recommended)
HCl	Sigma-Aldrich	320331	Use with caution (skin and eye protection are recommended)
glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
fluorsave	Calbiochem – Merck	345789
Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5mm tips	World Precision Instruments	501981
Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45mm tips	World Precision Instruments	501978
Dissecting Scissors, straight,10cm curved	World Precision Instruments	14394
Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S	World Precision Instruments	501218
Culture flasks	Corning	430168
Well-plates	Corning	3335
Thermanox coverslips	Thermo Scientific Nunc	12-565-27
microscope	Zeiss Apotome
spectrometer	Safas Xenius