Application de l'acide rétinoïque pour obtenir des cultures de ostéocytes de primaires ostéoblastes de souris
Summary
Traitement des ostéoblastes primaires de souris avec de l'acide rétinoïque produit une population homogène de cellules ramifiés portant des caractères morphologiques et moléculaires des ostéocytes. La méthode permet de surmonter la difficulté d'obtenir et de maintenir ostéocytes primaires en culture, et peut être avantageux d'étudier les cellules dérivées de modèles transgéniques.
Abstract
La nécessité pour les cultures de ostéocytes est bien connu de la communauté des chercheurs d'os; isolement des ostéocytes primaire est difficile et produit un faible nombre de cellules. Par conséquent, le système cellulaire le plus largement utilisé est la lignée de cellules ostéocytes MLO-Y4-like.
Le procédé décrit ici se réfère à l'utilisation de l'acide rétinoïque pour générer une population homogène de cellules ramifiées ayant des caractéristiques morphologiques et moléculaires ostéocytes.
Après isolement des ostéoblastes à partir de calvaria de souris, de l'acide tout-trans rétinoïque (ATRA) est ajouté au milieu de la cellule, et la surveillance de la cellule est réalisée tous les jours sous un microscope inversé. Premiers changements morphologiques sont détectables au bout de 2 jours de traitement et la différenciation est généralement complète en 5 jours, avec le développement progressif de dendrites, la perte de la capacité de produire la matrice extracellulaire, la régulation des marqueurs des ostéoblastes et la régulation des molécules spécifiques ostéocytes.
contenu "> le suivi des cellules quotidien est nécessaire en raison de la variabilité inhérente de cellules primaires, et le protocole peut être adapté avec une variation minime de cellules obtenues à partir de différentes souches de souris et appliquées à des modèles transgéniques.Le procédé est facile à réaliser et ne nécessite pas d'instruments spéciaux, il est hautement reproductible, et génère rapidement une population d'ostéocytes matures en absence totale de matrice extracellulaire, ce qui permet l'utilisation de ces cellules pour des applications biologiques illimitées.
Introduction
Les ostéocytes, le type de cellules osseuses les plus abondants, sont définitivement différenciés, les cellules hautement ramifiés profondément situés à l'intérieur du squelette. Le corps de la cellule de ostéocytes matures sont contenues dans les lacunes de l'os et avoir des formes diverses; ostéocytes avec les corps cellulaires allongées sont trouvés dans l'os cortical, alors que les ostéocytes arrondis sont plus fréquents dans l'os trabéculaire 1. Dendrites ramifiées s'étendent à partir du corps cellulaire et résident dans les canaux minuscules appelés canalicules, formant un réseau complexe qui fait plusieurs contacts non seulement avec d'autres ostéocytes, mais aussi avec d'autres types de cellules de l'os, la moelle osseuse, les vaisseaux sanguins et les péricytes associés. Par l'intermédiaire du liquide interstitiel contenu dans les lacunes et les canalicules, ostéocytes sont aussi en fin de compte connecté au système de circulation, ils peuvent donc influencer non seulement local, mais aussi les événements systémiques, et inversement leur comportement peut être régulée par les deux changements locaux et systémiques 2.
Laétude des ostéocytes a récemment pris de l'ampleur, grâce à plusieurs avancées techniques, telles que la génération de tissus-et des animaux transgéniques spécifiques des cellules, l'utilisation de techniques de microscopie puissants et de criblage moléculaire à haut débit 3,4. Cependant, la connaissance de ces cellules est encore incomplet, principalement en raison de la rareté relative des adéquate dans les modèles in vitro. En fait, les ostéocytes ont toujours été difficiles à obtenir et maintenir en culture en raison de l'emplacement de profondeur, et le faible niveau de la prolifération qui caractérise un tel type de cellule différenciée.
Au fil des années, un certain nombre de méthodes ont été développées pour isoler ostéocytes primaire 5-7, si elles produisent généralement des rendements de cellules faibles et comportent le risque que même quelques fibroblastes contaminants seront rapidement envahir le ostéocytes 8. Pour cette raison, le plus expérimental travaux in vitro ont été menées jusqu'à présent sur la cellule de l ostéocyte bien établieine MLO-Y4 9.
Méthodologies complémentaires in vitro pourraient améliorer la possibilité d'étudier ces cellules et pourraient améliorer l'analyse des ostéocytes biologie et la physiopathologie. Pour être largement adoptées, ces méthodes doivent être faciles à reproduire, et ne requièrent pas d'instruments spéciaux ou très longs pour atteindre la maturation des cellules. Fait important, le cas échéant à des cellules primaires, ils rendraient possible de tirer parti des animaux transgéniques. Nous avons récemment décrit que le traitement de la lignée cellulaire ostéoblastique MC3T3-E1 et des ostéoblastes primaires avec l'acide rétinoïque induit un changement phénotypique rapide conduisant à l'élaboration d'une population homogène de cellules ramifiés portant des caractères morphologiques et moléculaires des ostéocytes 10.
Tout-trans acide rétinoïque (ATRA) est un produit métabolique actif de la vitamine A, qui régule la transcription des gènes par les récepteurs nucléaires de l'acide rétinoïque (RAR) de liaison. RARlier à l'ADN comme hétérodimères avec les récepteurs X des rétinoïdes (RXR), conduisant finalement à la modulation de l'acide rétinoïque (RA) sensible gènes cibles 11. ATRA a été montré pour moduler la différenciation et la maturation de plusieurs types cellulaires, parmi lesquels d'autres cellules ramifiées telles que des cellules neuronales 12 et 13 podocytes.
Le procédé décrit ici est basé sur l'addition d'ATRA en ostéoblastes primaires. Pour être efficace, l'ATRA doit être ajoutée à un stade précis de maturation sur les cellules ensemencées à une densité définie; dans notre expérience, ces conditions sont essentielles pour obtenir le commutateur de phénotype de ostéoblastes ostéocytes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans les dernières années, le ostéocyte a émergé comme la cellule la plus centrale dans l'os. progrès de la recherche sont progressivement révèlent un certain nombre de propriétés de ostéocytes insoupçonnées ou non prouvées, qui sont d'une valeur inestimable pour la conception de nouveaux et de meilleurs traitements pour une variété de maladies osseuses. Toutefois, l'enquête de ostéocyte biologie a souffert de la disponibilité limitée des modèles in vitro à un point tel que les…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le financement a été fourni par "Progetto un concorso Fondazione IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico 2009-2010» de MD, et Associazione Bambino Nefropatico ABN Onlus, Milano
Materials
| Name | Company | Cat # | comments |
| Collagenase P | Roche Applied Science | 11213857001 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 15400054 | |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14175129 | Pre-warm at 37°C before use |
| Alpha-MEM | Invitrogen, Life Technologies | 22571038 | Pre-warm at 37°C before use |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Streptomycin/Penicillin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| ATRA | Sigma-Aldrich | R2625 | Protect ATRA from light |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in PBS and filter before use. Work always under a chemical hood. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 32670 | Can be added to the secondary antibody |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Janus Green | Sigma-Aldrich | 201677 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 176745 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| fluorsave | Calbiochem – Merck | 345789 | |
| Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5mm tips | World Precision Instruments | 501981 | |
| Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45mm tips | World Precision Instruments | 501978 | |
| Dissecting Scissors, straight,10cm curved | World Precision Instruments | 14394 | |
| Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S | World Precision Instruments | 501218 | |
| Culture flasks | Corning | 430168 | |
| Well-plates | Corning | 3335 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
| microscope | Zeiss Apotome | ||
| spectrometer | Safas Xenius |
Referências
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