初代マウス骨芽細胞から骨細胞培養物を入手するレチノイン酸のアプリケーション
Summary
レチノイン酸によるマウスの主骨芽細胞の治療は、骨細胞の形態学的および分子的特徴をもつ分岐した細胞の均質な集団を生成します。この方法は、培養中の一次骨細胞を取得し、維持することの難しさを克服し、トランスジェニックモデル由来の細胞を研究することが有利である。
Abstract
骨細胞培養の必要性は、骨の研究者のコミュニティによく知られている。一次骨細胞の単離は困難であり、低細胞数を生成する。したがって、最も広く使用される細胞系は、骨細胞様MLO-Y4細胞株である。
ここで説明する方法は、形態学的および分子骨細胞の機能と分岐した細胞の均質な集団を生成するために、レチノイン酸の使用を意味する。
マウス頭蓋冠骨芽細胞からの単離後、全トランスレチノイン酸（ATRA）を細胞培地に添加され、セル監視を倒立顕微鏡下で毎日行われる。最初の形態学的変化は、治療の2日後に検出可能であり、差別化は、一般的に骨芽細胞マーカーのレギュレーションダウンとアップレギュレーション骨細胞特異的分子の細胞外マトリックスを産生する能力が失われ、樹状突起の漸進的発展に伴い、5日間で完了する。
コンテンツ ">毎日のセル監視が原因初代細胞の固有の変動性に必要とされており、プロトコルは、異なるマウス系統から得た細胞への最小限の変化に適応し、トランスジェニックモデルに適用することができる。この方法は、実行が容易であり、特別な器具類を必要とせず、それは非常に再現性があり、かつ急速に無制限の生物学的用途のためのこれらの細胞の使用を可能にする、細胞外マトリックスの完全な非存在下で成熟した骨細胞集団を生成する。
Introduction
骨細胞、最も豊富な骨細胞型は、深く骨格内に位置する高度に分岐した細胞は最終分化している。成熟した骨細胞の細胞体は、骨小腔に含まれており、多様な形状を有する;丸みを帯びた骨細胞は、骨梁1に、より頻繁であるのに対し、細長い細胞体と骨細胞は、皮質骨で発見されています。分枝樹状突起は、他の骨ではなく、他の骨の細胞型、骨髄、血管及び関連する周皮細胞を有するだけでなく、複数の連絡先を行う複雑なウェブを形成する、細管と呼ばれる小さなチャネルにおいて細胞体から延びて存在する。小腔と細管間質液中に含まれる介して、骨細胞はまた、最終的に循環系に接続されているので、それらはローカルでなく、イベントだけでなく、全身に影響を与えることができ、その逆もその挙動は、局所および全身の両方の変化によって調節することができる2。
ザ·骨細胞の研究は、最近、このような組織および細胞特異的なトランスジェニック動物の生成、強力な顕微鏡技術のハイスループット分子スクリーニング3,4の使用などのいくつかの技術的な進歩のおかげで勢いを得ている。しかしながら、これらの細胞の知識は、主に、in vitroモデルにおいて適切な相対的希少性のために、依然として不完全である。実際に、骨細胞が原因の深い位置の取得と文化の中で維持するためには、常に困難であった、そしてそのような分化した細胞の種類を特徴づける低レベルの増殖している。
それらは一般的に低い細胞収量を生産し、さらにいくつかの混入線維芽細胞は急速に骨08過増殖というリスクを運ぶのに年に沿って、多数の方法は、一次骨5-7を単離するために開発されてきた。この理由のために、 インビトロの実験作業の中で最も、十分に確立された骨細胞の細胞リットルでこれまで行われてきたINE MLO-Y4 9。
追加のin vitroでの方法論は、これらの細胞を研究する可能性を高めることができるし、骨細胞生物学と病態生理の解析を向上させることができます。主に採用される、そのような方法は、再現することが容易であるべきであり、細胞成熟に達するために、特別な器具類又は非常に長い時間を必要としない。初代細胞に該当する場合重要なことに、彼らはそれが可能なトランスジェニック動物を利用することであろう。我々は最近、レチノイン酸による骨芽細胞株MC3T3-E1のと初代骨芽細胞の治療は骨10の形態学的および分子的特徴をもつ分岐した細胞の均質な集団の開発につながる迅速な表現型変化を誘導することを説明した。
オールトランスレチノイン酸（ATRA）は、核レチノイン酸受容体（RARは）を結合することにより遺伝子転写を調節するビタミンAの活性代謝産物である。 RARは最終的に、レチノイン酸（RA）応答性標的遺伝子の11の変調をもたらす、レチノイドX受容体（RXRの）とヘテロダイマーとしてDNAに結合する。 ATRAは、例えば、神経細胞12および有足13のような他の分岐した細胞は、それらのうち、いくつかの細胞型の分化および成熟を 調節することが示されている。
ここで説明する方法は、一次骨芽細胞に対するATRAの加算に基づいています。効果的にするために、ATRAは、定義された密度で播種した細胞上の正確な成熟段階で添加されなければならない;我々の経験では、これらの条件は、骨芽細胞から骨細胞への表現型のスイッチを得るために重要である。
Protocol
Representative Results
Discussion
最後の年で骨細胞は、骨の中の最も中心的な細胞として浮上している。研究の進歩は、徐々に骨様々な疾患のための新規およびより良い治療を設計するために多大な価値が以前に実証されていない又は疑われていない骨細胞の特性の数を明らかにしている。しかしながら、骨細胞生物学の調査は骨細胞様細胞株MLO-Y4が利用可能になる前に骨芽細胞が長期にわたってサロゲート細胞として使用?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
資金はMDに「PROGETTO concorso伊IRCCS病院周辺マッジョーレ総合病院2009年から2010年」、およびAssociazioneバンビーノNefropatico ABN Onlus、ミラノから提供された
Materials
| Name | Company | Cat # | comments |
| Collagenase P | Roche Applied Science | 11213857001 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 15400054 | |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14175129 | Pre-warm at 37°C before use |
| Alpha-MEM | Invitrogen, Life Technologies | 22571038 | Pre-warm at 37°C before use |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Streptomycin/Penicillin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| ATRA | Sigma-Aldrich | R2625 | Protect ATRA from light |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in PBS and filter before use. Work always under a chemical hood. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 32670 | Can be added to the secondary antibody |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Janus Green | Sigma-Aldrich | 201677 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 176745 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| fluorsave | Calbiochem – Merck | 345789 | |
| Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5mm tips | World Precision Instruments | 501981 | |
| Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45mm tips | World Precision Instruments | 501978 | |
| Dissecting Scissors, straight,10cm curved | World Precision Instruments | 14394 | |
| Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S | World Precision Instruments | 501218 | |
| Culture flasks | Corning | 430168 | |
| Well-plates | Corning | 3335 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
| microscope | Zeiss Apotome | ||
| spectrometer | Safas Xenius |
Referências
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