La aplicación de ácido retinoico para obtener cultivos de osteocitos principal del ratón osteoblastos
Summary
Tratamiento de los osteoblastos primarios de ratón con ácido retinoico produce una población homogénea de células ramificadas que llevan características morfológicas y moleculares de los osteocitos. El método supera la dificultad de obtención y mantenimiento de osteocitos primarios en cultivo, y puede ser ventajoso para estudiar las células derivadas de los modelos transgénicos.
Abstract
La necesidad de las culturas osteocitos es bien conocido por la comunidad de investigadores de hueso; aislamiento de osteocitos primaria es difícil y produce números bajos de células. Por lo tanto, el sistema celular más utilizado es la línea celular MLO-Y4-osteocitos similares.
El método aquí descrito se refiere al uso de ácido retinoico para generar una población homogénea de células ramificadas con características de osteocitos morfológicos y moleculares.
Después del aislamiento de los osteoblastos de bóveda craneal de ratón, se añade ácido trans-retinoico (ATRA) a medio celular, y seguimiento de células se lleva a cabo todos los días en un microscopio invertido. Primeros cambios morfológicos son detectables después de 2 días de tratamiento y la diferenciación se completa generalmente en 5 días, con el desarrollo progresivo de las dendritas, la pérdida de la capacidad de producir la matriz extracelular, la regulación por disminución de los marcadores de los osteoblastos y la regulación de las moléculas-osteocitos específico.
contenido "> monitoreo de celda diaria es necesaria debido a la variabilidad inherente de las células primarias, y el protocolo se puede adaptar con una mínima variación de las células obtenidas a partir de diferentes cepas de ratón y aplicados a los modelos transgénicos.El método es fácil de realizar y no requiere instrumentación especial, es altamente reproducible, y genera rápidamente una población de osteocitos maduros en ausencia completa de la matriz extracelular, permitiendo el uso de estas células para aplicaciones biológicas ilimitadas.
Introduction
Los osteocitos, el tipo de célula ósea más abundantes, son terminales diferenciadas, células altamente ramificadas profundamente ubicadas dentro del esqueleto. El cuerpo de la célula de osteocitos maduros están contenidas en las lagunas de hueso y tener diversas formas; osteocitos con cuerpos celulares alargados se encuentran en el hueso cortical, mientras que los osteocitos redondeadas son más frecuentes en el hueso trabecular 1. Dendritas ramificadas se extienden desde el cuerpo celular y residen en pequeños canales llamados canalículos, formando una intrincada red que hace múltiples contactos no sólo con otros osteocitos, sino también con otros tipos de células de hueso, médula ósea, vasos sanguíneos y los pericitos asociados. A través del fluido intersticial contenida en lagunas y canalículos, osteocitos son también conectado en última instancia al sistema de circulación, por lo tanto, pueden influir no sólo local, sino también eventos sistémicos, y viceversa su comportamiento puede ser regulada por ambos cambios locales y sistémicos 2.
Laestudio de osteocitos ha cobrado impulso recientemente, gracias a varios avances técnicos, tales como la generación de tejidos y animales transgénicos específicos de células, el uso de técnicas de microscopía de gran alcance y de alto rendimiento de cribado molecular de 3,4. Sin embargo, el conocimiento de estas células es todavía incompleta, debido principalmente a la escasez relativa de adecuada pt modelos in vitro. En realidad, los osteocitos han sido siempre difíciles de obtener y mantener en cultivo debido a la ubicación de profundidad, y el bajo nivel de proliferación que caracteriza a un tipo de célula diferenciada tal.
A lo largo de los años, un número de métodos se han desarrollado para aislar osteocitos primaria 5-7, a pesar de que generalmente producen bajos rendimientos celulares y llevan el riesgo de que incluso unos pocos fibroblastos contaminantes se crecer demasiado rápidamente la osteocitos 8. Por esta razón, la mayor parte experimental pt el trabajo in vitro ha llevado a cabo hasta ahora en la bien establecida de células osteocitos Line MLO-Y4 9.
Metodologías adicionales in vitro podría aumentar la posibilidad de estudiar estas células y podría mejorar el análisis de la biología osteocitos y fisiopatología. Para ser adoptado en gran parte, tales métodos deben ser fáciles de reproducir, y no requieren instrumentos especiales o tiempos muy largos para llegar a la maduración de células. Es importante destacar que, si es aplicable a células primarias, que harían posible tomar ventaja de los animales transgénicos. Recientemente hemos descrito que el tratamiento de la línea celular de osteoblastos MC3T3-E1 y de los osteoblastos primarios con ácido retinoico induce un cambio de fenotipo rápida que conduce al desarrollo de una población homogénea de células ramificadas que llevan características morfológicas y moleculares de los osteocitos 10.
El ácido trans-retinoico (ATRA) es un producto metabólico activa de la vitamina A, que regula la transcripción de genes mediante la unión a los receptores del ácido retinoico nucleares (RAR). RARunirse al ADN como heterodímeros con los receptores de retinoides X (RXRs), en última instancia conduce a la modulación de ácido retinoico (RA)-sensible genes diana 11. ATRA se ha demostrado que modulan la diferenciación y la maduración de varios tipos de células, entre ellos otras células ramificadas tales como las células neuronales 12 y podocitos 13.
El método aquí descrito se basa en la adición de ATRA a osteoblastos primarios. Para ser eficaz, el ATRA tiene que ser añadido en una etapa de maduración precisa sobre células cultivadas en placas a una densidad definida; en nuestra experiencia, estas condiciones son fundamentales para obtener el interruptor fenotipo de osteoblastos a osteocitos.
Protocol
Representative Results
Discussion
En los últimos años la osteocitos se ha convertido en la celda más central en la médula. Avances de investigación están revelando progresivamente una serie de propiedades de osteocitos antes insospechados o no probados, que son de gran valor para el diseño de nuevos y mejores tratamientos para una variedad de enfermedades óseas. Sin embargo, la investigación de la biología osteocitos ha estado sufriendo de la disponibilidad limitada de modelos in vitro hasta el punto de que los osteoblastos se han uti…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El financiamiento fue proporcionado por el "Progetto una concorso Fondazione IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico 2009-2010" de MD, y Associazione Bambino Nefropatico ABN Onlus, Milano
Materials
| Name | Company | Cat # | comments |
| Collagenase P | Roche Applied Science | 11213857001 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 15400054 | |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14175129 | Pre-warm at 37°C before use |
| Alpha-MEM | Invitrogen, Life Technologies | 22571038 | Pre-warm at 37°C before use |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Streptomycin/Penicillin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| ATRA | Sigma-Aldrich | R2625 | Protect ATRA from light |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in PBS and filter before use. Work always under a chemical hood. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 32670 | Can be added to the secondary antibody |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Janus Green | Sigma-Aldrich | 201677 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 176745 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| fluorsave | Calbiochem – Merck | 345789 | |
| Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5mm tips | World Precision Instruments | 501981 | |
| Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45mm tips | World Precision Instruments | 501978 | |
| Dissecting Scissors, straight,10cm curved | World Precision Instruments | 14394 | |
| Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S | World Precision Instruments | 501218 | |
| Culture flasks | Corning | 430168 | |
| Well-plates | Corning | 3335 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
| microscope | Zeiss Apotome | ||
| spectrometer | Safas Xenius |
Referências
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