تطبيق حمض الريتينويك الحصول الثقافات Osteocytes من الابتدائية ماوس خلايا الأوستيوبلاستس
Summary
علاج بانيات الماوس الأساسي مع حمض الريتينويك تنتج السكان متجانسة من الخلايا المتشعبة التي تحمل ميزات المورفولوجية والجزيئية من osteocytes. الأسلوب يتغلب على صعوبة الحصول على والحفاظ على osteocytes الأولية في الثقافة، ويمكن أن تكون مفيدة لدراسة الخلايا المشتقة من النماذج المعدلة وراثيا.
Abstract
الحاجة إلى الثقافات خلية عظمية هو معروف جيدا للمجتمع من الباحثين العظام؛ عزل osteocytes الأساسي هو صعبة وتنتج أعداد الخلايا منخفضة. ولذلك، فإن نظام الهاتف الخلوي الأكثر استخداما على نطاق واسع هو خط الخلية MLO-Y4 مثل خلية عظمية.
طريقة وصفها هنا يشير إلى استخدام حمض الريتينويك لتوليد السكان متجانسة من الخلايا المتشعبة مع ميزات خلية عظمية المورفولوجية والجزيئية.
بعد عزل الخلايا بانية العظم من calvaria الماوس، يتم إضافة حمض الريتينويك جميع العابر (ATRA) والمتوسطة الخلية، وتتم المراقبة اليومية الخلية تحت مجهر مقلوب. التغيرات المورفولوجية الأولى هي اكتشاف 2 بعد أيام من العلاج والتمايز اكتمال عموما في 5 أيام، مع التطوير التدريجي للالتشعبات، وفقدان القدرة على إنتاج مصفوفة خارج الخلية، بانخفاض التنظيم من علامات بناء العظم ويصل تنظيم جزيئات خلية عظمية محددة.
المحتويات "> وهناك حاجة للرصد خلية يوميا بسبب تقلب المتأصل في الخلايا الأولية، والبروتوكول يمكن تكييفها مع الحد الأدنى من الاختلاف إلى الخلايا التي تم الحصول عليها من سلالات الفئران مختلفة وتطبيقها على النماذج المعدلة وراثيا.طريقة سهلة لتنفيذ و لا يتطلب أدوات خاصة، هو تكرار للغاية، ويولد بسرعة عدد سكانها خلية عظمية ناضجة في غياب كامل للالمصفوفة خارج الخلية، مما يتيح استخدام هذه الخلايا للتطبيقات البيولوجية غير محدود.
Introduction
Osteocytes، والأكثر وفرة نوع من الخلايا العظمية، هي متباينة من شفائهم، وخلايا متشعبة للغاية وتقع عميقا داخل الهيكل العظمي. وترد خلايا الجسم من osteocytes ناضجة في الثغرات العظام ولها أشكال متنوعة؛ تم العثور على osteocytes مع الهيئات الخلية ممدود في العظام القشرية، في حين osteocytes مدورة هي أكثر شيوعا في العظام تربيقي 1. تمديد التشعبات متفرعة من جسم الخلية ويقيم في قنوات صغيرة تسمى نفيق، وتشكيل شبكة معقدة تجعل عدة جهات اتصال ليس فقط مع osteocytes الأخرى، ولكن أيضا مع أنواع أخرى خلايا العظام ونخاع العظام والأوعية الدموية وpericytes المرتبطة بها. من خلال السائل الخلالي الواردة في الثغرات ونفيق، osteocytes هي أيضا مرتبطة في نهاية المطاف إلى نظام تداول، وبالتالي فإنها يمكن أن تؤثر المحلي فحسب، بل أيضا الأحداث النظامية، والعكس بالعكس سلوكهم يمكن أن ينظم من قبل كل من التغيرات المحلية والنظامية 2.
الاكتسبت دراسة osteocytes مؤخرا الزخم، وذلك بفضل العديد من التطورات التقنية، مثل توليد الأنسجة والخلايا محددة الحيوانات المعدلة وراثيا، واستخدام تقنيات الفحص المجهري قوية وعالية الإنتاجية الفحص الجزيئي 3،4. ومع ذلك، ومعرفة هذه الخلايا لا تزال غير مكتملة، ويرجع ذلك أساسا إلى الندرة النسبية للنماذج كافية في المختبر. في الواقع، كانت osteocytes دائما من الصعب الحصول على والحفاظ في الثقافة نظرا للموقع العميقة، وانخفاض مستوى انتشار الذي يميز هذا نوع من الخلايا المتمايزة.
على طول السنين، وقد وضعت عددا من الأساليب لعزل osteocytes الأولية 5-7، على الرغم من أنها تنتج عادة غلة الخلية منخفض وتحمل المخاطر التي حتى عدد قليل من الخلايا الليفية تلويث سوف اكتسى بسرعة osteocytes 8. لهذا السبب، وقد أجريت معظم التجارب في المختبر حتى الآن العمل على راسخة خلية خلية عظمية لالمعهد الوطني للإحصاء MLO-Y4 9.
في المختبر منهجيات إضافية يمكن أن تعزز إمكانية دراسة هذه الخلايا ويمكن تحسين تحليل البيولوجيا والفيزيولوجيا المرضية خلية عظمية. أن يعتمد إلى حد كبير، وينبغي أن تكون مثل هذه الأساليب من السهل على الإنجاب، ولن تتطلب أجهزة خاصة أو أوقات طويلة جدا للوصول إلى نضوج الخلية. الأهم من ذلك، إن وجدت إلى الخلايا الأولية، فإنها تجعل من الممكن الاستفادة من الحيوانات المعدلة وراثيا. وصفنا مؤخرا أن العلاج من خط الخلايا العظمية MC3T3-E1 وبانيات الأولية مع حمض الريتينويك يؤدي الى تغيير النمط الظاهري السريع الرائدة في تطوير مجموعة من السكان متجانسة من الخلايا متشعبة تحمل الميزات المورفولوجية والجزيئية من osteocytes 10.
جميع العابر حمض الريتينويك (ATRA) هو منتج الأيض نشطة من فيتامين (أ) الذي ينظم النسخ الجيني بواسطة ربط مستقبلات حمض الريتينويك النووية (RARS). RARSربط الحمض النووي كما heterodimers مع ريتينويد X مستقبلات (RXRS)، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى التشكيل من حمض الريتينويك (RA) استجابة الجينات المستهدفة 11. وقد تبين ATRA لتعديل التمايز والنضج العديد من أنواع الخلايا، ومن بينها الخلايا المتشعبة الأخرى مثل الخلايا العصبية 12 و 13 podocytes.
طريقة وصفها هنا يقوم على إضافة ATRA لبانيات الأولية. لكي تكون فعالة، يجب أن ATRA أن تضاف في مرحلة النضج دقيقة على الخلايا مطلي في مناطق ذات كثافة محددة؛ في تجربتنا هذه الظروف الحرجة للحصول على مفتاح النمط الظاهري من بانيات لosteocytes.
Protocol
Representative Results
Discussion
في السنوات الأخيرة برزت باعتبارها الخلية خلية عظمية الأكثر مركزية في العظام. التقدم في البحوث ويكشف تدريجيا عدد من الخصائص خلية عظمية لم تكن متصورة أو غير مثبتة سابقا، والتي هي ذات قيمة هائلة لتصميم الرواية وعلاج أفضل لمجموعة متنوعة من أمراض العظام. ومع ذلك، والتحقي…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم توفير التمويل من قبل "PROGETTO على كونكورسو FONDAZIONE IRCCS أسبيدال ماجيوري Policlinico 2009-2010" لدكتوراه في الطب، وAssociazione بامبينو Nefropatico ABN ONLUS، ميلانو
Materials
| Name | Company | Cat # | comments |
| Collagenase P | Roche Applied Science | 11213857001 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 15400054 | |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14175129 | Pre-warm at 37°C before use |
| Alpha-MEM | Invitrogen, Life Technologies | 22571038 | Pre-warm at 37°C before use |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Streptomycin/Penicillin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| ATRA | Sigma-Aldrich | R2625 | Protect ATRA from light |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in PBS and filter before use. Work always under a chemical hood. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 32670 | Can be added to the secondary antibody |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Janus Green | Sigma-Aldrich | 201677 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 176745 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| fluorsave | Calbiochem – Merck | 345789 | |
| Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5mm tips | World Precision Instruments | 501981 | |
| Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45mm tips | World Precision Instruments | 501978 | |
| Dissecting Scissors, straight,10cm curved | World Precision Instruments | 14394 | |
| Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S | World Precision Instruments | 501218 | |
| Culture flasks | Corning | 430168 | |
| Well-plates | Corning | 3335 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
| microscope | Zeiss Apotome | ||
| spectrometer | Safas Xenius |
Referências
- Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., Müller, R. Towards quantitative 3D imaging of the osteocyte lacuno-canalicular network. Bone. 47 (5), 848-858 (2010).
- Cheng, F., Hulley, P. The osteocyte–a novel endocrine regulator of body phosphate homeostasis. Maturitas. 67 (4), 327-338 (2010).
- Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. 45 (4), 682-692 (2009).
- Dallas, S. L., Bonewald, L. F. Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte. Ann N Y Acad Sci. 1192, 437-443 (2010).
- van der Plas, A., Nijweide, P. J. Isolation and purification of osteocytes. J Bone Miner Res. 7 (4), 389-396 (1992).
- Nijweide, P. J., van der Plas, A., Alblas, M. J., Klein-Nulend, J. Osteocyte isolation and culture. Methods Mol Med. 80, 41-50 (2003).
- Stern, A. R., Stern, M. M., Van Dyke, M. E., Jähn, K., Prideaux, M., Bonewald, L. F. Isolation and culture of primary osteocytes from the long bones of skeletally mature and aged mice. Biotechniques. 52 (6), 361-373 .
- Kalajzic, I., Matthews, B. G., Torreggiani, E., Harris, M. A., Divieti Pajevic, P., Harris, S. E. In vitro and in vivo approaches to study osteocyte. Bone. 54 (2), 296-206 .
- Bonewald, L. F. Establishment and characterization of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4. J Bone Miner Metab. 17 (1), 61-65 (1999).
- Mattinzoli, D., et al. A novel model of in vitro osteocytogenesis induced by retinoic acid treatment. Eur Cell Mater. 24, 403-425 (2012).
- Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. Retinoids in embryonal development. Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).
- Clagett-Dame, M., McNeill, E. M., Muley, P. D. Role of all-trans retinoic acid in neurite outgrowth and axonal elongation. J Neurobiol. 66 (7), 739-756 (2006).
- Vaughan, M. R., et al. ATRA induces podocyte differentiation and alters nephrin and podocin expression in vitro and in vivo. Kidney Int. 68 (1), 133-144 (2005).
- Dodig, M., et al. Identification of a TAAT-containing motif required for high level expression of the COL1A1 promoter in differentiated osteoblasts of transgenic mice. J Biol Chem. 271 (27), 16422-16429 (1996).
- Burry, R. W. Immunocytochemistry. A practical guide for biomedical research. , (2010).
- Woo, S. M., Rosse, r. J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. J Bone Miner Res. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Gu, G., Nars, M., Hentune, n. T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell Tissue Res. 323 (2), 263-271 (2006).
- Boukhechba, F., et al. Human primary osteocyte differentiation in a 3D culture system. J Bone Miner Res. 24 (11), 1927-1935 (2009).
- Krishnan, V., Dhurjati, R., Vogler, E. A., Mastro, A. M. Osteogenesis in vitro: from pre-osteoblasts to osteocytes: a contribution from the Osteobiology Research Group, The Pennsylvania State University. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46 (1), 28-35 .
- Irie, K., Ejiri, S., Sakakura, Y., Shibui, T., Yajima, T. Matrix mineralization as a trigger for osteocyte maturation. J Histochem Cytochem. 56 (6), 561-567 .
- Hirao, M., et al. Oxygen tension is an important mediator of the transformation of osteoblasts to osteocytes. J Bone Miner Metab. 25 (5), 266-276 (2007).
- Brounais, B., et al. Long term oncostatin M treatment induces an osteocyte-like differentiation on osteosarcoma and calvaria. Bone. 44 (5), 830-839 (2009).
- Gupta, R. R., Yoo, D. J., Hebert, C., Niger, C., Stains, J. P. Induction of an osteocyte-like phenotype by fibroblast growth factor-2. Biochem Biophys Res Commun. 402 (2), 258-264 (2010).
- Poole, K. E., et al. Sclerostin is a delayed secreted product of osteocytes that inhibits bone formation. FASEB J. 19 (13), 1842-1844 (2005).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The Osteocyte: An Endocrine Cell and More. Endocr Rev. 34 (5), 658-690 (2013).
