Toepassing van retinoinezuur aan Osteocyten Culturen van primaire muizen osteoblasten verkrijgen
Summary
Behandeling van primaire muis osteoblasten met retinoinezuur produceert een homogene populatie van vertakte cellen die morfologische en moleculaire kenmerken van osteocyten. De werkwijze overwint de moeilijkheid van het verkrijgen en handhaven primaire osteocyten in kweek, en kan voordelig zijn om cellen uit transgene modellen bestuderen.
Abstract
De behoefte aan osteocyt culturen is goed bekend bij de gemeenschap van bot onderzoekers; isolatie van primaire osteocyten is moeilijk en produceert lage cel aantallen. Daarom is de meest gebruikte mobiele systeem is de osteocyt-achtige MLO-Y4 cellijn.
De hier beschreven methode heeft betrekking op het gebruik van retinoïnezuur een homogene populatie van vertakte cellen met morfologische en moleculaire kenmerken osteocyten genereren.
Na isolatie van osteoblasten uit muizen calvaria, is all-trans retinoic acid (ATRA) toegevoegd aan cel medium en mobiele controle wordt dagelijks uitgevoerd onder een omgekeerde microscoop. Eerste morfologische veranderingen zijn detecteerbaar na 2 dagen van de behandeling en differentiatie is over het algemeen in 5 dagen, met een geleidelijke ontwikkeling van dendrieten, verlies van het vermogen om de extracellulaire matrix te produceren, down-regulatie van osteoblasten markers en up-regulatie van osteocyt-specifieke moleculen.
gehalte "> Dagelijkse mobiele controle is nodig vanwege de inherente variabiliteit van elektrische elementen, en het protocol kan worden aangepast met minimale variatie cellen verkregen van verschillende muizen en toegepast om transgene modellen.De werkwijze is eenvoudig uit te voeren en vereist geen speciale instrumenten vereist, is het zeer reproduceerbaar en snel genereert een volwassen osteocyten populatie volledige afwezigheid van extracellulaire matrix, die het gebruik van deze cellen voor onbeperkte biologische toepassingen.
Introduction
Osteocyten, de meest voorkomende soort bot cel, zijn terminaal gedifferentieerde, sterk vertakte cellen diep gelegen in het skelet. De cel lichaam van volwassen osteocyten zijn opgenomen in het bot lacunes en hebben diverse vormen; osteocyten met langwerpige cel lichamen zijn gevonden in de corticale bot, terwijl afgeronde osteocyten komen vaker voor in het trabeculair bot 1. Vertakte dendrieten verlengen van het cellichaam en wonen in kleine kanalen genoemd canaliculi, vormen een ingewikkeld web dat meerdere contacten niet alleen met andere osteocyten, maar ook met andere bot celtypen, het beenmerg, de bloedvaten en de bijbehorende pericytes maakt. Door de interstitiële vloeistof in leemten en canaliculi, osteocyten zijn uiteindelijk ook aangesloten op het circulatiesysteem, kunnen derhalve niet alleen lokaal maar ook systemische bijwerkingen, en omgekeerd hun gedrag kan door lokale en systemische 2 veranderingen worden geregeld beïnvloeden.
Destudie van osteocyten onlangs stroomversnelling, dankzij een aantal technische ontwikkelingen, zoals het genereren van weefsel-en celspecifieke transgene dieren, het gebruik van krachtige microscopische technieken en hoog-moleculaire screening 3,4. Echter, de kennis van deze cellen is nog onvolledig, voornamelijk als gevolg van de relatieve schaarste van voldoende in vitro modellen. Eigenlijk osteocyten zijn altijd moeilijk te verkrijgen en in cultuur te behouden vanwege de diepe ligging en het lage niveau van proliferatie dat zo'n gedifferentieerde celtype kenmerkt.
Langs de jaren is een aantal methoden ontwikkeld om primaire osteocyten 5-7 isoleren, maar ze produceren in het algemeen lage opbrengsten cel en het risico in dat zelfs een paar verontreinigende fibroblasten snel zal overwoekeren de osteocyten 8. Daarom heeft meest experimentele in vitro werk dusver uitgevoerd op de gevestigde osteocyten cel line MLO-Y4 9.
Extra in vitro methoden kon de mogelijkheid van het bestuderen van deze cellen te verbeteren en zou de analyse van osteocyt biologie en pathofysiologie verbeteren. Grotendeels worden aangenomen, moet deze methoden gemakkelijk te reproduceren, en zou geen bijzondere instrumenten of zeer lange tijd nodig heeft om celrijping bereiken. Belangrijk, indien van toepassing op primaire cellen, zouden zij het mogelijk te maken van transgene dieren. We hebben recent beschreven dat de behandeling van de osteoblast cellijn MC3T3-E1 en primaire osteoblasten met retinoïnezuur induceert een snelle fenotype wijziging leidt tot de ontwikkeling van een homogene populatie van vertakte cellen die morfologische en moleculaire kenmerken van osteocyten 10.
All-trans retinoïnezuur (ATRA) is actief metaboliet van vitamine A die gentranscriptie reguleert door binding nucleaire retinoïnezuur receptoren (RAR). RARbinden aan DNA als heterodimeren met de retinoïde X receptor (RXR), wat uiteindelijk leidt tot modulering van retinoïnezuur (RA)-responsieve doelgenen 11. ATRA is aangetoond dat differentiatie en rijping van verscheidene celtypes moduleren, waaronder andere vertakte cellen zoals neuronale cellen 12 en podocytes 13.
De hier beschreven methode is gebaseerd op de toevoeging van ATRA primaire osteoblasten. Om doeltreffend te zijn, ATRA te worden toegevoegd in een nauwkeurige maturatie op cellen uitgeplaat bij een bepaalde dichtheid; in onze ervaring deze voorwaarden zijn cruciaal voor het fenotype switch te verkrijgen van osteoblasten tot osteocyten.
Protocol
Representative Results
Discussion
In de afgelopen jaren de osteocyt heeft ontpopt als de meest centrale cel in het bot. Onderzoek voorschotten worden geleidelijk onthullen van een aantal niet eerder verdacht of onbewezen osteocyt eigenschappen, die van enorme waarde voor het ontwerpen van nieuwe en betere behandeling voor een verscheidenheid van botziekten. Echter, onderzoek osteocyten biologie last van de beperkte beschikbaarheid van in vitro modellen zodanig osteoblasten die zijn gebruikt als surrogaat cellen gedurende een lange periode voor …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De financiering werd verstrekt door "Progetto een concorso Fondazione IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico 2009-2010" naar MD, en Associazione Bambino Nefropatico ABN Onlus, Milano
Materials
| Name | Company | Cat # | comments |
| Collagenase P | Roche Applied Science | 11213857001 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 15400054 | |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14175129 | Pre-warm at 37°C before use |
| Alpha-MEM | Invitrogen, Life Technologies | 22571038 | Pre-warm at 37°C before use |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Streptomycin/Penicillin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| ATRA | Sigma-Aldrich | R2625 | Protect ATRA from light |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in PBS and filter before use. Work always under a chemical hood. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 32670 | Can be added to the secondary antibody |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Janus Green | Sigma-Aldrich | 201677 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 176745 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| fluorsave | Calbiochem – Merck | 345789 | |
| Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5mm tips | World Precision Instruments | 501981 | |
| Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45mm tips | World Precision Instruments | 501978 | |
| Dissecting Scissors, straight,10cm curved | World Precision Instruments | 14394 | |
| Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S | World Precision Instruments | 501218 | |
| Culture flasks | Corning | 430168 | |
| Well-plates | Corning | 3335 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
| microscope | Zeiss Apotome | ||
| spectrometer | Safas Xenius |
Referências
- Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., Müller, R. Towards quantitative 3D imaging of the osteocyte lacuno-canalicular network. Bone. 47 (5), 848-858 (2010).
- Cheng, F., Hulley, P. The osteocyte–a novel endocrine regulator of body phosphate homeostasis. Maturitas. 67 (4), 327-338 (2010).
- Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. 45 (4), 682-692 (2009).
- Dallas, S. L., Bonewald, L. F. Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte. Ann N Y Acad Sci. 1192, 437-443 (2010).
- van der Plas, A., Nijweide, P. J. Isolation and purification of osteocytes. J Bone Miner Res. 7 (4), 389-396 (1992).
- Nijweide, P. J., van der Plas, A., Alblas, M. J., Klein-Nulend, J. Osteocyte isolation and culture. Methods Mol Med. 80, 41-50 (2003).
- Stern, A. R., Stern, M. M., Van Dyke, M. E., Jähn, K., Prideaux, M., Bonewald, L. F. Isolation and culture of primary osteocytes from the long bones of skeletally mature and aged mice. Biotechniques. 52 (6), 361-373 .
- Kalajzic, I., Matthews, B. G., Torreggiani, E., Harris, M. A., Divieti Pajevic, P., Harris, S. E. In vitro and in vivo approaches to study osteocyte. Bone. 54 (2), 296-206 .
- Bonewald, L. F. Establishment and characterization of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4. J Bone Miner Metab. 17 (1), 61-65 (1999).
- Mattinzoli, D., et al. A novel model of in vitro osteocytogenesis induced by retinoic acid treatment. Eur Cell Mater. 24, 403-425 (2012).
- Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. Retinoids in embryonal development. Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).
- Clagett-Dame, M., McNeill, E. M., Muley, P. D. Role of all-trans retinoic acid in neurite outgrowth and axonal elongation. J Neurobiol. 66 (7), 739-756 (2006).
- Vaughan, M. R., et al. ATRA induces podocyte differentiation and alters nephrin and podocin expression in vitro and in vivo. Kidney Int. 68 (1), 133-144 (2005).
- Dodig, M., et al. Identification of a TAAT-containing motif required for high level expression of the COL1A1 promoter in differentiated osteoblasts of transgenic mice. J Biol Chem. 271 (27), 16422-16429 (1996).
- Burry, R. W. Immunocytochemistry. A practical guide for biomedical research. , (2010).
- Woo, S. M., Rosse, r. J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. J Bone Miner Res. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Gu, G., Nars, M., Hentune, n. T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell Tissue Res. 323 (2), 263-271 (2006).
- Boukhechba, F., et al. Human primary osteocyte differentiation in a 3D culture system. J Bone Miner Res. 24 (11), 1927-1935 (2009).
- Krishnan, V., Dhurjati, R., Vogler, E. A., Mastro, A. M. Osteogenesis in vitro: from pre-osteoblasts to osteocytes: a contribution from the Osteobiology Research Group, The Pennsylvania State University. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46 (1), 28-35 .
- Irie, K., Ejiri, S., Sakakura, Y., Shibui, T., Yajima, T. Matrix mineralization as a trigger for osteocyte maturation. J Histochem Cytochem. 56 (6), 561-567 .
- Hirao, M., et al. Oxygen tension is an important mediator of the transformation of osteoblasts to osteocytes. J Bone Miner Metab. 25 (5), 266-276 (2007).
- Brounais, B., et al. Long term oncostatin M treatment induces an osteocyte-like differentiation on osteosarcoma and calvaria. Bone. 44 (5), 830-839 (2009).
- Gupta, R. R., Yoo, D. J., Hebert, C., Niger, C., Stains, J. P. Induction of an osteocyte-like phenotype by fibroblast growth factor-2. Biochem Biophys Res Commun. 402 (2), 258-264 (2010).
- Poole, K. E., et al. Sclerostin is a delayed secreted product of osteocytes that inhibits bone formation. FASEB J. 19 (13), 1842-1844 (2005).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The Osteocyte: An Endocrine Cell and More. Endocr Rev. 34 (5), 658-690 (2013).
