Применение ретиноевой кислотой получить остеоцитов культур из первичных мыши остеобластов
Summary
Лечение первичных остеобластов мыши с ретиноевой кислоты производит гомогенную популяцию разветвленных клеток, несущих морфологические и молекулярные особенности остеоцитов. Способ преодолевает трудность получения и сохранения первичных остеоцитов в культуре, и может быть выгодным для изучения клетки, полученные из трансгенных моделей.
Abstract
Необходимость остеоцитарного культур хорошо известно в сообщество исследователей кости; изоляция первичной остеоцитов трудно и производит небольшое число клеток. Таким образом, наиболее широко используется система сотовой связи является остеоцит, как MLO-Y4 клеточной линии.
Способ здесь описано относится к использованию ретиноевой кислотой с образованием гомогенной популяции клеток с разветвленными морфологических и молекулярных особенностей остеоцитарного.
После выделения остеобластов из свода черепа мыши, полностью транс-ретиноевой кислоты (ATRA) добавляют к клеточной среде, а также мониторинг соты выполняется ежедневно под инвертированным микроскопом. Первые морфологические изменения обнаруживаются после 2 дней лечения и дифференциации обычно завершается в течение 5 дней, с прогрессивного развития дендритов, потеря способности производить внеклеточный матрикс, понижающей регуляции остеобластов маркеров и до регулирования остеоцитарного конкретных молекул.
Содержание "> Мониторинг Ежедневно клеток необходим из-за присущего изменчивости первичных клеток, и протокол может быть адаптирован с минимальным изменением в клетках, полученных из различных линий мышей и применяемых к трансгенных моделей.Метод прост для выполнения и не требует специального оборудования, это очень воспроизводимые, и быстро генерирует зрелого населения остеоцитарного в полном отсутствии внеклеточного матрикса, что позволяет использовать эти клетки для неограниченного биологических применений.
Introduction
Остеоциты, наиболее распространенный тип костных клеток, неизлечимо дифференцированной, очень разветвленные клетки глубоко расположенные в скелете. Тело клетки зрелой остеоцитов содержатся в костном лакун и имеют различные формы; остеоцитов с удлиненных тел клеток находятся в кортикальной кости, в то время как закругленные остеоцитов становятся все более частыми в губчатой кости 1. Разветвленные дендриты простираются от тела клетки и проживать в крошечных каналов называемых канальцы, образуя запутанную сеть, которая делает несколько контактов не только с другими остеоцитов, но и с другими типами костных клеток, костного мозга, кровеносных сосудов и связанных с ними перицитами. Через межклеточной жидкости, содержащейся в лакун и канальцев, остеоциты также в конечном счете, подключен к системе циркуляции, поэтому они могут влиять не только местные, но и системные события, и наоборот их поведение может регулироваться как местных, так и системных изменений 2.
Изучение остеоцитов недавно набрала обороты, благодаря несколько технических достижений, таких как генерации ткани и клеточных конкретных трансгенных животных, использование мощных методов микроскопии и высокой пропускной молекулярной скрининга 3,4. Тем не менее, знание этих клеток еще не завершен, в основном за счет относительного дефицита адекватной в пробирке моделей. На самом деле, остеоциты были всегда трудно получить и поддерживать в культуре из-за глубокого расположения, и низкий уровень пролиферации, которая характеризует такой дифференцированный тип клеток.
Вдоль лет, ряд методов были разработаны, чтобы изолировать первичный остеоцитов 5-7, хотя они обычно производят урожаи низкие клеток и несут риск, что даже несколько загрязняющих фибробласты быстро перерастают остеоцитов 8. По этой причине, самый экспериментальный в пробирке работы было проведено до сих пор на устоявшихся остеоцитов клеток лНИС MLO-Y4 9.
Дополнительные методологии в пробирке может повысить возможность изучения этих клеток и может улучшить анализ остеоцитарного биологии и патофизиологии. Чтобы быть в значительной степени приняты, такие методы должны быть легко воспроизвести, и не потребует специальных инструментов или очень длинные раза до клеток созревание. Важно отметить, что если применимо к первичных клеток, они дают возможность использовать преимущества трансгенных животных. Мы недавно описали, что обработка остеобластов линии клеток MC3T3-E1 и первичных остеобластов с ретиноевой кислоты вызывает быстрое изменение фенотипа, ведущий к развитию гомогенной популяции клеток, несущих разветвленных морфологические и молекулярные особенности остеоцитами 10.
Полностью транс-ретиноевой кислоты (ATRA) является активным продуктом метаболической трансформации витамина А, который регулирует транскрипцию генов путем связывания ядерных рецепторов ретиноевой кислоты (РАКС). RARsсвязываются с ДНК, как гетеродимеров с ретиноидных X рецепторов (RXRs), в конечном итоге приводит к модуляции ретиноевой кислоты (RA)-отзывчивым генов-мишеней 11. ATRA, как было показано модулировать дифференцировку и созревание нескольких типов клеток, в том числе другие разветвленные клетки, такие как нервные клетки 12 и подоцитах 13.
Способ здесь описано основана на добавлении к ATRA первичных остеобластов. Чтобы быть эффективной, ATRA должен быть добавлен в точном стадии созревания на клетки высевали при определенной плотности; в нашем опыте эти условия имеют решающее значение для получения переключатель фенотип от остеобластов к остеоцитов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В последние годы остеоцитов стала самой центральной ячейки в кости. Научно-исследовательские достижения постепенно выявить ряд ранее непредвиденных или недоказанных свойств остеоцитарного, которые имеют огромное значение для проектирования новых и лучшее лечение для различных кос?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование было предоставлено "Progetto Concorso Fondazione IRCCS Оспедале Маджоре Поликлинико 2009-2010", чтобы доктор медицинских наук, и Associazione Bambino Nefropatico ABN Онлус, Милан
Materials
| Name | Company | Cat # | comments |
| Collagenase P | Roche Applied Science | 11213857001 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 15400054 | |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14175129 | Pre-warm at 37°C before use |
| Alpha-MEM | Invitrogen, Life Technologies | 22571038 | Pre-warm at 37°C before use |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Streptomycin/Penicillin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| ATRA | Sigma-Aldrich | R2625 | Protect ATRA from light |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in PBS and filter before use. Work always under a chemical hood. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 32670 | Can be added to the secondary antibody |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Janus Green | Sigma-Aldrich | 201677 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 176745 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| fluorsave | Calbiochem – Merck | 345789 | |
| Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5mm tips | World Precision Instruments | 501981 | |
| Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45mm tips | World Precision Instruments | 501978 | |
| Dissecting Scissors, straight,10cm curved | World Precision Instruments | 14394 | |
| Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S | World Precision Instruments | 501218 | |
| Culture flasks | Corning | 430168 | |
| Well-plates | Corning | 3335 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
| microscope | Zeiss Apotome | ||
| spectrometer | Safas Xenius |
Referências
- Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., Müller, R. Towards quantitative 3D imaging of the osteocyte lacuno-canalicular network. Bone. 47 (5), 848-858 (2010).
- Cheng, F., Hulley, P. The osteocyte–a novel endocrine regulator of body phosphate homeostasis. Maturitas. 67 (4), 327-338 (2010).
- Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. 45 (4), 682-692 (2009).
- Dallas, S. L., Bonewald, L. F. Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte. Ann N Y Acad Sci. 1192, 437-443 (2010).
- van der Plas, A., Nijweide, P. J. Isolation and purification of osteocytes. J Bone Miner Res. 7 (4), 389-396 (1992).
- Nijweide, P. J., van der Plas, A., Alblas, M. J., Klein-Nulend, J. Osteocyte isolation and culture. Methods Mol Med. 80, 41-50 (2003).
- Stern, A. R., Stern, M. M., Van Dyke, M. E., Jähn, K., Prideaux, M., Bonewald, L. F. Isolation and culture of primary osteocytes from the long bones of skeletally mature and aged mice. Biotechniques. 52 (6), 361-373 .
- Kalajzic, I., Matthews, B. G., Torreggiani, E., Harris, M. A., Divieti Pajevic, P., Harris, S. E. In vitro and in vivo approaches to study osteocyte. Bone. 54 (2), 296-206 .
- Bonewald, L. F. Establishment and characterization of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4. J Bone Miner Metab. 17 (1), 61-65 (1999).
- Mattinzoli, D., et al. A novel model of in vitro osteocytogenesis induced by retinoic acid treatment. Eur Cell Mater. 24, 403-425 (2012).
- Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. Retinoids in embryonal development. Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).
- Clagett-Dame, M., McNeill, E. M., Muley, P. D. Role of all-trans retinoic acid in neurite outgrowth and axonal elongation. J Neurobiol. 66 (7), 739-756 (2006).
- Vaughan, M. R., et al. ATRA induces podocyte differentiation and alters nephrin and podocin expression in vitro and in vivo. Kidney Int. 68 (1), 133-144 (2005).
- Dodig, M., et al. Identification of a TAAT-containing motif required for high level expression of the COL1A1 promoter in differentiated osteoblasts of transgenic mice. J Biol Chem. 271 (27), 16422-16429 (1996).
- Burry, R. W. Immunocytochemistry. A practical guide for biomedical research. , (2010).
- Woo, S. M., Rosse, r. J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. J Bone Miner Res. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Gu, G., Nars, M., Hentune, n. T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell Tissue Res. 323 (2), 263-271 (2006).
- Boukhechba, F., et al. Human primary osteocyte differentiation in a 3D culture system. J Bone Miner Res. 24 (11), 1927-1935 (2009).
- Krishnan, V., Dhurjati, R., Vogler, E. A., Mastro, A. M. Osteogenesis in vitro: from pre-osteoblasts to osteocytes: a contribution from the Osteobiology Research Group, The Pennsylvania State University. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46 (1), 28-35 .
- Irie, K., Ejiri, S., Sakakura, Y., Shibui, T., Yajima, T. Matrix mineralization as a trigger for osteocyte maturation. J Histochem Cytochem. 56 (6), 561-567 .
- Hirao, M., et al. Oxygen tension is an important mediator of the transformation of osteoblasts to osteocytes. J Bone Miner Metab. 25 (5), 266-276 (2007).
- Brounais, B., et al. Long term oncostatin M treatment induces an osteocyte-like differentiation on osteosarcoma and calvaria. Bone. 44 (5), 830-839 (2009).
- Gupta, R. R., Yoo, D. J., Hebert, C., Niger, C., Stains, J. P. Induction of an osteocyte-like phenotype by fibroblast growth factor-2. Biochem Biophys Res Commun. 402 (2), 258-264 (2010).
- Poole, K. E., et al. Sclerostin is a delayed secreted product of osteocytes that inhibits bone formation. FASEB J. 19 (13), 1842-1844 (2005).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The Osteocyte: An Endocrine Cell and More. Endocr Rev. 34 (5), 658-690 (2013).
