Retinoik asit ile osteoblastların primer fare tedavisi kemik hücresinin morfolojik ve moleküler özellikler taşıyan dallanmış homojen bir hücreler popülasyonu üretir. Yöntem, elde edilmesi ve kültürü birincil kemik hücresinin korumanın zorluğu üstesinden gelir ve transjenik modelleri türetilen hücreler çalışma avantajlı olabilir.
Osteosit kültürleri için olan ihtiyaç iyi kemik araştırmacıların eden bilinmektedir; Birincil osteositlere izolasyonu zordur ve düşük hücre sayıları üretmektedir. Bu nedenle, en yaygın olarak kullanılan hücre sistemi osteosit benzeri MLO-Y4 bir hücre hattıdır.
Burada tarif edilen yöntem, morfolojik ve moleküler osteosit özelliklere sahip dallanmış homojen bir hücreler popülasyonunu üretmek üzere retinoik asidin kullanılması anlamına gelir.
Fare kafatası alınan osteoblastların izole edildikten sonra, bütün-trans retinoik asit (ATRA) hücre ortamına ilave edilir ve hücre izleme ters döndürülmüş bir mikroskop altında her gün yapılır. Üretim morfolojik değişimler tedavi ve farklılaşma 2 gün sonra tespit edilebilir dendrit hücre dışı matrisi üretme yeteneği kaybı, osteoblast belirteçlerin aşağı-regülasyonu ve ilerleyici gelişmesiyle birlikte, 5 gün içinde tamamlanır yukarı-regülasyonu osteosit özgü moleküllerin.
içeriği "> günlük hücre izlenmesi için birincil hücrelerin doğal değişkenlik gereklidir ve protokol, farklı fare türlerinden elde edilen ve transjenik modelleri uygulanan hücrelere, minimal değişiklik gösteren uyarlanabilir.Yöntem, gerçekleştirilmesi kolaydır ve özel aletler gerektirmez, bu yüksek oranda tekrarlanabilir olduğunu ve hızlı bir şekilde sınırsız biyolojik uygulamalarda bu hücrelerin kullanımına izin veren, hücre dışı matrisin tam yokluğunda olgun osteosit nüfus oluşturur.
Kemik hücresinin, en bol kemik hücre tipi, derin iskeleti içinde yer alan büyük ölçüde dallanmış hücreler, terminal olarak farklılaşmış bulunmaktadır. Olgun osteositler ait hücre vücut kemik boşluklar içerdiği ve çeşitli şekillere sahip olan; yuvarlak osteositlerde trabeküler kemikte 1 daha sık iken uzun hücre organları ile osteositlerde, kortikal kemik bulunur. Dallı dendritler diğer kemik hücresinin ile değil, aynı zamanda diğer kemik hücre türleri, kemik iliği, kan damarları ve ilgili perisitlerin ile sadece birden fazla kişi karmaşık hale getiren bir ağ-yapının oluşturulması, kanalcığı adı verilen küçük kanallarda hücre gövdesinden uzanan ve bulunur. Boşluklar ve kanalcık içerdiği interstisyel sıvının sayesinde, osteositler nedenle lokal hem de sistemik etkinlik, ya da tam tersi davranışları hem lokal hem de sistemik değişikliklerle 2 ile kontrol edilebilir, sadece etkileyebilir, aynı zamanda sonuçta dolaşım sistemine bağlanmıştır.
kemik hücresinin çalışması son zamanlarda, bu tür doku-ve hücreye özel transgenik hayvanların üretimi, güçlü mikroskopi teknikleri ve yüksek verimli tarama moleküler 3,4 kullanımı gibi çeşitli teknik ilerlemeler, sayesinde ivme kazanmıştır. Bununla birlikte, bu hücrelerin bilgisi esas olarak vitro modellerde yeterli göreli azlığı, yine eksik. Aslında osteositlerde nedeniyle derin konumu elde etmek ve kültür korumak için her zaman zor olmuştur, ve böyle bir farklılaşmış hücre tipini karakterize çoğalma düşük seviye var.
Genellikle düşük verimli olduğu hücre ve hatta birkaç kirletici fibroblast hızla osteositler 8 büyümek doyurmaya riski taşıyan da yıllar boyunca, bir dizi yöntem, birincil kemik hücresinin 5-7 izole etmek için geliştirilmiştir. Bu nedenle, in vitro çalışmalarında en deneysel köklü osteosit hücre l hakkında şu ana kadar yapılmıştırine MLO-Y4 9.
Ek in vitro metodolojiler bu hücreleri okuyan olasılığını artırabilir ve osteosit biyoloji ve patofizyolojinin analizini artırabilirsiniz. Büyük ölçüde kabul edilmesi, bu tür yöntemler çoğaltmak kolay olmalı ve hücre olgunlaşmasını ulaşmak için özel aletler ya da çok uzun bir süre gerektirecektir olmaz. Birincil hücreleri varsa da önemlisi, bu mümkün transgenik hayvanların yararlanmak olur. Yakın zamanda osteoblast hücre hattı MC3T3-E1 ve retinoik asit ile tedavi, birincil osteoblastların osteositler 10 morfolojik ve moleküler özellikler taşıyan dallanmış homojen bir hücreler nüfus gelişimine yol açan hızlı bir fenotip değişikliklerini oluşturmaktadır anlatılmıştır.
All-trans retinoik asit (ATRA), nükleer retinoik asit reseptörleri (RAR'lar) bağlanmak suretiyle gen transkripsiyonunu düzenler A vitamini aktif bir metabolizma ürünüdür. RAR'larsonuçta retinoik asit (RA)-duyarlı hedef genler 11 modülasyonu yol açan, retinoid X reseptörleri (RXR'ler) ile heterodimerler olarak DNA'ya bağlanır. ATRA gibi nöronal hücre 12 ve 13 gibi diğer podocytes dallanmış hücreler, aralarında, çeşitli hücre tiplerinin farklılaşmasını ve olgunlaşmasını modüle ettiği gösterilmiştir.
Burada tarif edilen yöntem, birincil osteoblastların için ATRA eklenmesi dayanmaktadır. Etkili olmak için, ATRA tanımlanmış bir yoğunlukta kaplama hücreleri üzerinde kesin bir olgunlaşma safhasında ilave edilmesi gerekir; deneyimlerimiz bu koşullar osteoblast gelen osteositlere için fenotip anahtarını elde etmek için önemlidir.
Son yıllarda osteosit kemiğin en merkezi hücre olarak ortaya çıkmıştır. Araştırma gelişmeler kademeli kemik hastalıklarının çeşitli için yeni ve daha iyi tedavi tasarımı için çok büyük bir değer olan, daha önce ya da umulmadık kanıtlanmamış osteosit özellikleri, bir çok açıklayıcıdır. Bununla birlikte, osteosit biyoloji araştırılması osteosit benzeri hücre hattı MLO-Y4 yayınlanmadan önce osteoblastlar, uzun bir süre boyunca taşıyıcı hücre olarak kullanılmış olduğu bi…
The authors have nothing to disclose.
Finansman "Progetto bir Concorso Fondazione IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico 2009-2010" MD, ve Associazione Bambino Nefropatico ABN Onlus, Milano tarafından sağlandı
Name | Company | Cat # | comments |
Collagenase P | Roche Applied Science | 11213857001 | |
Trypsin | Gibco, Life Technologies | 15400054 | |
HBSS | Gibco, Life Technologies | 14175129 | Pre-warm at 37°C before use |
Alpha-MEM | Invitrogen, Life Technologies | 22571038 | Pre-warm at 37°C before use |
FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
Streptomycin/Penicillin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
ATRA | Sigma-Aldrich | R2625 | Protect ATRA from light |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in PBS and filter before use. Work always under a chemical hood. |
DAPI | Sigma-Aldrich | 32670 | Can be added to the secondary antibody |
Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
Janus Green | Sigma-Aldrich | 201677 | |
Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 176745 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
fluorsave | Calbiochem – Merck | 345789 | |
Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5mm tips | World Precision Instruments | 501981 | |
Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45mm tips | World Precision Instruments | 501978 | |
Dissecting Scissors, straight,10cm curved | World Precision Instruments | 14394 | |
Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S | World Precision Instruments | 501218 | |
Culture flasks | Corning | 430168 | |
Well-plates | Corning | 3335 | |
Thermanox coverslips | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
microscope | Zeiss Apotome | ||
spectrometer | Safas Xenius |