-سهلت صوتنة المناعي تلطيخ المرحلة الجنينية في وقت متأخر من اليرقات و<em> ذبابة الفاكهة</em> الأنسجة<em> في الموقع</em

Summary

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Abstract

الدراسات التي أجريت في الدروسوفيلاميلانوجاستر الأجنة واليرقات توفر البصيرة الحاسمة في العمليات التنموية مثل مواصفات مصير الخلايا وتوالد الأعضاء. المناعية يسمح التصور تطوير الأنسجة والأعضاء. ومع ذلك، بشرة الواقية التي تشكل في نهاية مرحلة التطور الجنيني يمنع تخلل الأجسام المضادة في أواخر مرحلة الأجنة واليرقات. بينما تشريح قبل المناعية يستخدم بانتظام لتحليل أنسجة اليرقات ذبابة الفاكهة، فإنه يثبت عدم كفاءة بعض التحليلات لأن الأنسجة الصغيرة قد يكون من الصعب تحديد وعزل. يوفر صوتنة بديلا للتشريح اليرقات في بروتوكولات المناعية ذبابة الفاكهة. أنه يسمح للسريع، وتجهيز وقت واحد من عدد كبير من الأجنة في مرحلة متأخرة واليرقات ويحافظ على التشكل في الموقعي. بعد التثبيت في الفورمالديهايد، وsonicated عينة. ثم يتم إخضاع العينة لالمناعية مع مستضد معين نملة الأساسيibodies والأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى لتصور أنواع الخلايا المستهدفة وبروتينات معينة عبر مضان المجهري. خلال عملية صوتنة، تحديد المكان المناسب لتحقيق sonicating فوق العينة، فضلا عن مدة وشدة صوتنة، أمر بالغ الأهمية. قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات طفيفة الاضافيه المناعية بروتوكولات قياسية للبقع عالية الجودة. عن الأجسام المضادة مع إشارة إلى انخفاض نسبة الضوضاء، مرات حضانة أطول ضرورية عادة. كدليل على مفهوم لهذا البروتوكول، سهلت صوتنة، وتبين لنا immunostains من ثلاثة أنواع الأنسجة (الخصيتين والمبيض، والأنسجة العصبية) في مجموعة من المراحل التنموية.

Introduction

ذبابة الفاكهة الأجنة واليرقات توفر نموذجا ممتازا لدراسة العمليات التنموية في كثير من الأعضاء والأنسجة. التصوير من الخلايا الفردية غالبا ما يكون ضروريا في هذه الدراسات من أجل التأكد من البيئات المعقدة التي تتطور الخلايا. التصور من الخلايا في الأنسجة ويمكن تحقيق ذلك من خلال المناعية. موصوفة وصفا جيدا المناعية وجود بروتوكولات لذبابة الفاكهة الأنسجة الجنينية <17 ساعة بعد وضع البيض (أيل ليماسول) ^1-3. ومع ذلك، فإن أشكال بشرة وقائية في نهاية مرحلة التطور الجنيني، ومنع تخلل فعالية الأجسام المضادة. وبالتالي، هذه البروتوكولات المناعية غير فعالة في تحليل أنسجة الأجنة في المراحل المتأخرة وفي مراحل لاحقة من نمو اليرقات (1 ^ش الطور (L1)، 2 الطور ^الثاني (L2)، و 3 الطور ^الثالث (L3)). هذا عدم الكفاءة تفرض عائقا أمام فهمنا للعمليات الحيوية التي تحدث خلال هذه الفترة التنموية طويلة ^4. TISSرق تشريح هي تقنية تستخدم على نطاق واسع للتحايل على هذا الحاجز ^5-7. ومع ذلك، يمكن تشريح يثبت غير فعالة. يمكن استخراج المرهونة من قبل صعوبة في تحديد أو عزل الجنينية والأنسجة اليرقات. وعلاوة على ذلك، وإزالة المادية من الأنسجة المستهدفة قد يسبب الضرر الناجم عن تمزق لهم أو بعدم استخراجها في مجملها.

صوتنة هو الطريقة التي توظف الموجات الصوتية لزعزعة التفاعلات بين الجزيئات. وقد تم استخدامه لتعطيل سلامة بشرة اليرقات ذبابة الفاكهة من أجل immunostain تطوير أنواع الخلايا العصبية ^6. وقد تم تكييف هذا البروتوكول لimmunostain أواخر المرحلة الجنينية والغدد التناسلية اليرقات، التي يمكن أن تكون صغيرة مثل 50μm في قطر ^8-10. من خلال هذه الدراسات، وقد اتسمت عملية الخلايا الجذعية الجرثومية (GSC) تشكيل مكانة الذكور في مرحلة متأخرة أجنة ذبابة الفاكهة ^8-10 وآليات تنظيم وتطوير الخلايا الجذعية المتنوعةتم توضيح ferentiation في مرحلة متأخرة الغدد التناسلية الجنينية واليرقات ^9-12. وبالتالي، يوفر صوتنة بديل فعال لتشريح الأنسجة التي قد تكون صعبة بسبب حجم الأنسجة. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن المناعية الأنسجة ذبابة الفاكهة في الموقع، وترك الخلايا داخل سياق كائن كامل والحفاظ على التشكل في الموقعي. هنا، نحن تصف بروتوكول خطوة بخطوة لالمناعية مضان من أواخر المرحلة الجنينية في وقت مبكر من خلال / الأنسجة منتصف L3 في الموقع. ويظهر تحليل ذبابة الفاكهة الغدد التناسلية والعصبية في الأنسجة ممثل النتائج لإثبات فعالية هذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييفها هذا البروتوكول المناعية لتحليل الأنسجة ذبابة الفاكهة الأخرى وكذلك في أنسجة الكائنات الحية الأخرى ذات بشرة الخارجي.

Protocol

1. إعداد قفص مجموعة تخدير الشباب، والذباب خصبة مع CO 2. نقل الذباب تخدير إلى القفص. للحصول على العائد الأمثل، استخدم 100-120 الذباب الكبار تتراوح بين 2-7 أيام من العمر في 4: 1 نسبة الإناث إلى الذكور. السماح الذباب فترة الت…

Representative Results

للتدليل على فعالية المناعية القائم على صوتنة في تحليل المراحل المتأخرة الجنينية والأنسجة اليرقات في الموقع، تم تجهيز البرية من نوع الأجنة واليرقات لالمناعية من الخصية والمبيض، والأنسجة العصبية. تم تصوير عينات عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر وتظهر نتائج ممثل?…

Discussion

يوفر هذا البروتوكول طريقة لذبابة الفاكهة بنجاح immunostain استهداف الجنينية والأنسجة اليرقات في الموقع، وبالتالي القضاء على الحاجة للتشريح. وفقا لبروتوكولات مسبقة لتلطيخ الأجنة المبكرة ^1،2،3، تتم إزالة الغشاء المشيمي باستخدام 50٪ التبييض (NaOCl). يتم إصلاحها…

Materials

			Table 1: Reagents and Buffers
Phosphate Buffer Triton X-100 (PBTx)	For 5 L: 500 mL PBS 10X 4.45 L ddH2O 50 mL Triton 10%	Store at room temperature.
Phosphate Buffer Saline 10x (PBS 10X)	For 1 L in dH2O: 80 g NaCl 2 g KCl 14.4g Na2HPO4 2.4 g KH2PO4	Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 degrees C.
Triton 10%	For 50 mL: 5 mL of Triton 5 mL of PBS 10X 45 mL of ddH2O	Rock to mix. Store at room temperature.
PEMS	0.1 M Pipes (pH 6.9) 2.0 mM MgSO4 1.0 mM EGTA	Store at room temperature.
Pipes	For a 400ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH	Dissolve Pipes in 300 mL dH2Oand then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 mL with dH2O and autoclave. Store at room temperature.
Formaldehyde	37% formaldehyde by weight in methanol	Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Heptane	n-Heptane	CAS 142-82-5. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Methanol	Methanol	CAS 67-56-1. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Phosphate Buffer Tween (PBTw)	To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10%	Filter sterilize after adding all components. Store at 4 degrees C.
Tween 10%	For 50 mL: 5 mL Tween 5 mL of PBS 10X 40 mL of ddH2O	Rock to mix. Store at room temperature.
Bovine Serum Albumin/Phosphate Buffer Tween (BBTw)	To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10% 1 g Bovine Serum Albumin (BSA)	Add BSA then sterilize using a 0.2 micrometer vacuum filter unit. Store at 4 degrees C.
Normal Goat Serum (NGS)	To make 10 mL: Normal Goat Serum (Jackson ImmunoResearch Laboratories Code: 005-000-121) 10 mL ddH2O	Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 micrometer syrninge filter. Store aliquots at -20 degrees C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)	To make 100 mL: 25 mL ddH2O 1 mL Tris HCl (1M, pH 7.5) 2.5 g of DABCO solid (CAS: 281-57-9) 3.5 mL 6N HCl 250 uL 10N NaOH 70 mL glycerol	In 250 mL beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 degrees C.
DABCO + p-phenylenediamine (PPD) Solution	1.765 mL NaHCO3 0.353 Na2CO3 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3)	Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 uL of PPD solution to 500 uL of DABCO. Store aliquots at -20 degrees C.
Apple juice plates	To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0) 45 g granulated sugar (store bought) 500 mL Apple juice (store bought) 15 mL Tegosept 10% 1.5 mL ddH2O	Add agar to ddH2O in 4L flask then autoclave for 30 minuntes. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10mL volumes into 35 mm petri dishes and let stand at room temperature to solidfy. Store at 4 degrees C.
Tegosept 10%	To make 100mL: 10g Tegosept 100 mL Ethanol	Store aliquots at -20 degrees C
Yeast paste	~50 g Dry Active Yeast	Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 degrees C.
			Table 2: Staining Materials
DAPI	1:1000	Invitrogen	D3571 //// Stock at 5mg/mL
rabbit anti-Vasa	1:250		A gift from Ruth Lehmann
mouse anti-Fasciclin III	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7G10
mouse anti-1B1	1:4	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1
guniea pig anti-Traffic Jam	1:2500		A gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003)
mouse anti-Prospero	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Prospero MR1A
rat anti-Elav	1:30	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Rat-elav 7EBA10 anti-elav
mouse anti-Repo	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	8D12 anti-Repo
goat anti-rabbit Alexa546	1:500	Invitrogen	A11010
goat anti-mouse Alexa488	1:500	Invitrogen	A11029
goat anti-guniea pig Alexa633	1:500	Invitrogen	A21105
goat anti-rat Alexa488	1:500	Invitrogen	A11006
			Table 3: Materials and Equipment
Fly Cages	Hand-made; Genesee Scientific Corporation	Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101	Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.
Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier	Branson	Model: Branson Digital Sonifier 250
Sonicator Probe	Branson	Model #: 102C (CE)	EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Syringe filter	Nalgene	190-25-20	0.2 micrometer cellulose, acetate membrane filter
Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software	Microscope: Olympus Light source: Lumen Dynamics Camera: Q-Imaging Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.	Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc Light source: X-Cite 120Q Camera: RETIGA-SRV Imaging Software: Slidebook 5.0
Vacuum filter unit	Nalgene	450-0020	0.2 micrometer cellulose nitrate membrane filter