Sonication facilitée immunofluorescence de phase tardive embryonnaire et larvaire<em> Drosophila</em> tissus<em> In Situ</em

Summary

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Abstract

Les études réalisées chez Drosophila melanogaster embryons et des larves donnent un aperçu essentiel dans les processus de développement tels que la spécification du destin cellulaire et l'organogenèse. Immunomarquage permet la visualisation de tissus et organes en développement. Cependant, une cuticule protectrice qui se forme à la fin de l'embryogenèse empêche la pénétration des anticorps dans des embryons à un stade avancé et des larves. Bien que la dissection avant immunomarquage est régulièrement utilisé pour analyser les tissus des larves de drosophile, il s'avère inefficace pour certaines analyses parce que les petits tissus peuvent être difficiles à localiser et isoler. Le traitement par ultrasons offre une alternative à la dissection dans les protocoles de larves de drosophile immunomarquage. Il permet d'obtenir rapidement un traitement simultané d'un grand nombre d'embryons à un stade avancé et des larves et maintient la morphologie situ. Après fixation dans le formol, un échantillon est soumis à une sonication. L'échantillon est ensuite soumis à une coloration immunologique spécifique de l'antigène avec ant primaireet ibodies Anticorps secondaires marqués par fluorescence pour visualiser types de cellules cibles spécifiques et des protéines par microscopie de fluorescence. Au cours du processus de sonication, une mise en place correcte de la sonde de sonication ci-dessus de l'échantillon, ainsi que la durée et l'intensité de la sonification, est critique. Modifications mineures supplementaires aux protocoles d'immunomarquage standard peuvent être nécessaires pour les taches de haute qualité. Pour les anticorps ayant un faible rapport signal à bruit, de plus longs temps d'incubation sont typiquement nécessaires. Comme une preuve de concept pour ce protocole de traitement par ultrasons facilitée, nous montrons immunomarquages ​​de trois types de tissus (testicules, ovaires, et des tissus neuronaux) à une série de stades de développement.

Introduction

Embryons de drosophile et les larves fournissent un excellent modèle pour étudier les processus de développement dans de nombreux organes et tissus. L'imagerie de cellules individuelles est souvent nécessaire dans ces études afin de déterminer les milieux complexes dans lesquelles les cellules se développent. La visualisation des cellules dans les tissus peut être réalisée par coloration immunologique. Bien décrits immunomarquage protocoles existent pour les tissus embryonnaires de drosophile <17 h après la ponte (AEL) ^1-3. Cependant, une protection formes de la cuticule vers la fin de l'embryogenèse, empêchant la pénétration d'anticorps efficace. Ainsi, ces protocoles immunocoloration sont inefficaces dans l'analyse des tissus d'embryons à un stade avancé et dans les étapes ultérieures du développement larvaire ^(1er stade (L1), 2 ^ème stade (L2), et 3 ^e stade (L3)). Cette inefficacité impose un obstacle à notre compréhension des processus dynamiques qui se produisent pendant cette période de développement prolongée ^4. Tissue dissection est une technique largement utilisée pour contourner cette barrière ^5-7. Cependant, la dissection peut se révéler inefficace. L'extraction peut être encombré par la difficulté à trouver ou à isoler l'embryon et les tissus des larves. En outre, l'élimination physique des tissus cibles peut causer des dommages par les rompre ou en omettant de les extraire dans leur intégralité.

La sonication est une méthode qui utilise des ondes sonores pour perturber les interactions intermoléculaires. Elle a été utilisée pour perturber l'intégrité de la cuticule des larves de Drosophila immunocoloration pour développer des types cellulaires neuronaux ^6. Ce protocole a été adapté pour immunocoloration embryonnaire à un stade avancé et les gonades des larves, qui peuvent être aussi petites que 50 microns de diamètre ^8-10. Grâce à ces études, le processus de cellules souches de la lignée germinale (CGC) formation masculine de niche a été caractérisé à un stade avancé embryons de drosophile ^8-10 et les mécanismes régulant le développement des cellules souches et difdifféren- à un stade avancé gonades embryonnaires et les larves ont été élucidée ^9-12. Ainsi, la sonication fournit une alternative efficace à la dissection de tissu qui peut être difficile en raison de la taille des tissus. En outre, il permet l'immunomarquage des tissus de Drosophila in situ, ce qui laisse les cellules dans le cadre de l'ensemble de l'organisme et le maintien de la morphologie in situ. Ici, nous décrivons un protocole étape par étape pour la fluorescence immunomarquage de l'embryon à un stade avancé grâce à début / mi-L3 tissus in situ. Analyse de la drosophile gonadique et le tissu nerveux est représenté dans les résultats représentatifs pour démontrer l'efficacité de ce protocole. De plus, ce protocole d'immunocoloration peut être adapté pour analyser d'autres tissus de Drosophila ainsi que des tissus chez d'autres organismes par une cuticule externe.

Protocol

1: Préparation d'une cage de collecte Anesthésier les jeunes, les mouches fertiles avec du CO 2. Transfert mouches anesthésiés dans une cage. Pour obtenir un rendement optimal, utilisez 100-120 mouches adultes allant de 2-7 jours d'âge à un ratio de 4: 1 femmes-hommes. Laisser vol une période d'acclimatation appropriée, ~ 24 heures avant d'obtenir l'échantillon pour la fixation. Si la cage a été mis en place avec des femelles vierges accouplées à des mâles, une uti…

Representative Results

Pour démontrer l'efficacité de l'immunomarquage base ultrasons dans l'analyse de l'embryon à un stade avancé et les tissus des larves in situ, les embryons de type sauvage et des larves ont été traitées pour immunomarquage des testicules, des ovaires, et le tissu neural. Les échantillons ont été imagées par microscopie à foyer commun et les résultats représentatifs sont présentés (figure 1 et figure 2). Les résultats montrent que le protocole d?…

Discussion

Ce protocole fournit un procédé pour cibler avec succès immunocoloration embryonnaire de Drosophila et tissus larvaires in situ, ce qui élimine la nécessité d'une dissection. Selon les protocoles antérieurs pour la coloration des embryons précoces ^1,2,3, la membrane chorionique est éliminé en utilisant 50% de javel (NaOCl). Les échantillons sont fixés dans du formol et du méthanol. Parce que la cuticule des larves provoque échantillon âgé de flotter, la totalité de l&#39…

Materials

			Table 1: Reagents and Buffers
Phosphate Buffer Triton X-100 (PBTx)	For 5 L: 500 mL PBS 10X 4.45 L ddH2O 50 mL Triton 10%	Store at room temperature.
Phosphate Buffer Saline 10x (PBS 10X)	For 1 L in dH2O: 80 g NaCl 2 g KCl 14.4g Na2HPO4 2.4 g KH2PO4	Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 degrees C.
Triton 10%	For 50 mL: 5 mL of Triton 5 mL of PBS 10X 45 mL of ddH2O	Rock to mix. Store at room temperature.
PEMS	0.1 M Pipes (pH 6.9) 2.0 mM MgSO4 1.0 mM EGTA	Store at room temperature.
Pipes	For a 400ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH	Dissolve Pipes in 300 mL dH2Oand then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 mL with dH2O and autoclave. Store at room temperature.
Formaldehyde	37% formaldehyde by weight in methanol	Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Heptane	n-Heptane	CAS 142-82-5. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Methanol	Methanol	CAS 67-56-1. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Phosphate Buffer Tween (PBTw)	To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10%	Filter sterilize after adding all components. Store at 4 degrees C.
Tween 10%	For 50 mL: 5 mL Tween 5 mL of PBS 10X 40 mL of ddH2O	Rock to mix. Store at room temperature.
Bovine Serum Albumin/Phosphate Buffer Tween (BBTw)	To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10% 1 g Bovine Serum Albumin (BSA)	Add BSA then sterilize using a 0.2 micrometer vacuum filter unit. Store at 4 degrees C.
Normal Goat Serum (NGS)	To make 10 mL: Normal Goat Serum (Jackson ImmunoResearch Laboratories Code: 005-000-121) 10 mL ddH2O	Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 micrometer syrninge filter. Store aliquots at -20 degrees C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)	To make 100 mL: 25 mL ddH2O 1 mL Tris HCl (1M, pH 7.5) 2.5 g of DABCO solid (CAS: 281-57-9) 3.5 mL 6N HCl 250 uL 10N NaOH 70 mL glycerol	In 250 mL beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 degrees C.
DABCO + p-phenylenediamine (PPD) Solution	1.765 mL NaHCO3 0.353 Na2CO3 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3)	Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 uL of PPD solution to 500 uL of DABCO. Store aliquots at -20 degrees C.
Apple juice plates	To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0) 45 g granulated sugar (store bought) 500 mL Apple juice (store bought) 15 mL Tegosept 10% 1.5 mL ddH2O	Add agar to ddH2O in 4L flask then autoclave for 30 minuntes. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10mL volumes into 35 mm petri dishes and let stand at room temperature to solidfy. Store at 4 degrees C.
Tegosept 10%	To make 100mL: 10g Tegosept 100 mL Ethanol	Store aliquots at -20 degrees C
Yeast paste	~50 g Dry Active Yeast	Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 degrees C.
			Table 2: Staining Materials
DAPI	1:1000	Invitrogen	D3571 //// Stock at 5mg/mL
rabbit anti-Vasa	1:250		A gift from Ruth Lehmann
mouse anti-Fasciclin III	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7G10
mouse anti-1B1	1:4	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1
guniea pig anti-Traffic Jam	1:2500		A gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003)
mouse anti-Prospero	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Prospero MR1A
rat anti-Elav	1:30	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Rat-elav 7EBA10 anti-elav
mouse anti-Repo	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	8D12 anti-Repo
goat anti-rabbit Alexa546	1:500	Invitrogen	A11010
goat anti-mouse Alexa488	1:500	Invitrogen	A11029
goat anti-guniea pig Alexa633	1:500	Invitrogen	A21105
goat anti-rat Alexa488	1:500	Invitrogen	A11006
			Table 3: Materials and Equipment
Fly Cages	Hand-made; Genesee Scientific Corporation	Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101	Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.
Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier	Branson	Model: Branson Digital Sonifier 250
Sonicator Probe	Branson	Model #: 102C (CE)	EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Syringe filter	Nalgene	190-25-20	0.2 micrometer cellulose, acetate membrane filter
Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software	Microscope: Olympus Light source: Lumen Dynamics Camera: Q-Imaging Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.	Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc Light source: X-Cite 120Q Camera: RETIGA-SRV Imaging Software: Slidebook 5.0
Vacuum filter unit	Nalgene	450-0020	0.2 micrometer cellulose nitrate membrane filter