La sonicación-facilitado Inmunofluorescencia tinción de etapa tardía embrionario y larval<em> Drosophila</em> Tejidos<em> In Situ</em

Summary

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Abstract

Los estudios realizados en Drosophila melanogaster embriones y larvas proporcionan información fundamental en los procesos de desarrollo, tales como la especificación del destino celular y la organogénesis. La inmunotinción permite la visualización de desarrollo de tejidos y órganos. Sin embargo, una cutícula protectora que se forma en el extremo de la embriogénesis impide la penetración de los anticuerpos en embriones de fase tardía y las larvas. Mientras que la disección antes de la inmunotinción se utiliza regularmente para analizar los tejidos larvarios Drosophila, resulta ineficaz para algunos análisis porque los tejidos pequeños pueden ser difíciles de localizar y aislar. La sonicación proporciona una alternativa a la disección en los protocolos de inmunotinción Drosophila larval. Permite la rápida tramitación y simultánea de un gran número de embriones en etapa tardía y larvas y mantiene pt la morfología situ. Después de la fijación en formaldehído, se sometió a ultrasonidos una muestra. Muestra a continuación, se somete a inmunotinción con la hormiga primaria específica de antígenoibodies y secundaria de anticuerpos marcados con fluorescencia para visualizar los tipos de células diana y proteínas específicas mediante microscopía de fluorescencia. Durante el proceso de sonicación, la colocación apropiada de una sonda de sonicación encima de la muestra, así como la duración y la intensidad de la sonicación, es crítico. Modificaciones menores Adicionales a los protocolos de inmunotinción estándar pueden ser necesarios para las manchas de alta calidad. Para los anticuerpos con baja relación señal a ruido, los tiempos de incubación más largos son típicamente necesario. Como una prueba de concepto para este protocolo de tratamiento con ultrasonidos-facilitado, mostramos inmunotinciones de tres tipos de tejidos (testículos, los ovarios y los tejidos neuronales) en una serie de etapas de desarrollo.

Introduction

Embriones y larvas de Drosophila proporcionan un excelente modelo para estudiar los procesos de desarrollo en muchos órganos y tejidos. Obtención de imágenes de células individuales es a menudo necesario en estos estudios a fin de determinar los entornos complejos en los que se desarrollan las células. Visualización de las células en los tejidos se puede lograr mediante inmunotinción. Bueno-describen inmunotinción existen protocolos para tejidos embrionarios de Drosophila <17 h después de la puesta de huevos (AEL) ^1-3. Sin embargo, una protección formas cutícula hacia el final de la embriogénesis, la prevención de la permeación de anticuerpo eficaz. Por lo tanto, estos protocolos de inmunotinción son ineficientes en el análisis de los tejidos en embriones de la última etapa y en etapas posteriores de desarrollo de las larvas (1 ^st estadio (L1), 2 ^nd estadio (L2), y 3 ^º estadio (L3)). Esta ineficiencia impone una barrera para nuestra comprensión de los procesos dinámicos que ocurren durante este período de desarrollo prolongado ^4. Tissdisección ue es una técnica ampliamente utilizada para eludir esta barrera ^5-7. Sin embargo, la disección puede resultar ineficaz. La extracción puede ser gravado por la dificultad en localizar o aislar embriones y tejidos larvarios. Por otra parte, la eliminación física de los tejidos diana puede causar daño rompiendo ellos o al no extraer en su totalidad.

La sonicación es un método que emplea ondas sonoras para perturbar las interacciones intermoleculares. Se ha utilizado para interrumpir la integridad de la cutícula de las larvas de Drosophila con el fin de inmunotinción desarrollo de tipos de células neuronales ^6. Este protocolo ha sido adaptado a inmunotinción de embriones en etapa tardía y las gónadas de larvas, que pueden ser tan pequeñas como 50 micras de diámetro ^8-10. A través de estos estudios, el proceso de células madre de línea germinal (GSC) formación nicho macho se ha caracterizado en la etapa tardía embriones de Drosophila ^8-10 y los mecanismos que regulan el desarrollo de células madre y el DIFdiferencia- en la etapa tardía gónadas embrionarias y las larvas se han dilucidado ^9-12. Por lo tanto, sonicación proporciona una alternativa eficiente para la disección de tejidos que puede ser difícil debido al tamaño del tejido. Además, permite la inmunotinción de tejidos de Drosophila in situ, dejando a las células en el contexto de todo el organismo y mantener pt la morfología situ. A continuación, describimos un protocolo paso a paso para la fluorescencia inmunotinción de la última etapa embrionaria hasta principios / mediados de los tejidos L3 in situ. Análisis de Drosophila gonadal y neural tejido se muestra en los resultados representativos para demostrar la eficacia de este protocolo. Además, este protocolo de inmunotinción puede estar adaptado para analizar otros tejidos de Drosophila, así como en otros organismos tejidos con una cutícula externa.

Protocol

1 Preparación de una jaula de Colección Anestesiar jóvenes, moscas fértiles con CO 2. Transferencia moscas anestesiados a una jaula. Para obtener un rendimiento óptimo, utilice 100-120 moscas adultas que van de 2-7 días de edad en una proporción de 4: 1 de mujeres a hombres. Permitir moscas un período de aclimatación apropiada, ~ 24 horas antes de la obtención de la muestra para la fijación. Si la jaula se creó con hembras vírgenes se aparearon con machos, un uso un 36 – periodo de acl…

Representative Results

Para demostrar la eficacia de la inmunotinción a base de ultrasonidos en el análisis de embriones en etapa tardía y tejidos larvarios in situ, de tipo salvaje embriones y larvas fueron procesadas para la inmunotinción de los testículos, los ovarios, y el tejido neural. Las muestras se obtuvieron imágenes a través de microscopía confocal y los resultados representativos se muestran (Figura 1 y Figura 2). Los resultados revelan que el protocolo descrito es eficaz para la …

Discussion

Este protocolo proporciona un método para dirigir con éxito inmunotinción Drosophila embrionario y en los tejidos de las larvas in situ, eliminando así la necesidad de disección. Según los protocolos anteriores para la tinción de embriones tempranos ^1,2,3, la membrana coriónica se elimina usando 50% de lejía (NaOCl). Las muestras se fijaron en formaldehído y metanol. Debido a la cutícula de las larvas causa de muestra mayores a flotar, toda la muestra se hace pasar luego a través…

Materials

			Table 1: Reagents and Buffers
Phosphate Buffer Triton X-100 (PBTx)	For 5 L: 500 mL PBS 10X 4.45 L ddH2O 50 mL Triton 10%	Store at room temperature.
Phosphate Buffer Saline 10x (PBS 10X)	For 1 L in dH2O: 80 g NaCl 2 g KCl 14.4g Na2HPO4 2.4 g KH2PO4	Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 degrees C.
Triton 10%	For 50 mL: 5 mL of Triton 5 mL of PBS 10X 45 mL of ddH2O	Rock to mix. Store at room temperature.
PEMS	0.1 M Pipes (pH 6.9) 2.0 mM MgSO4 1.0 mM EGTA	Store at room temperature.
Pipes	For a 400ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH	Dissolve Pipes in 300 mL dH2Oand then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 mL with dH2O and autoclave. Store at room temperature.
Formaldehyde	37% formaldehyde by weight in methanol	Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Heptane	n-Heptane	CAS 142-82-5. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Methanol	Methanol	CAS 67-56-1. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Phosphate Buffer Tween (PBTw)	To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10%	Filter sterilize after adding all components. Store at 4 degrees C.
Tween 10%	For 50 mL: 5 mL Tween 5 mL of PBS 10X 40 mL of ddH2O	Rock to mix. Store at room temperature.
Bovine Serum Albumin/Phosphate Buffer Tween (BBTw)	To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10% 1 g Bovine Serum Albumin (BSA)	Add BSA then sterilize using a 0.2 micrometer vacuum filter unit. Store at 4 degrees C.
Normal Goat Serum (NGS)	To make 10 mL: Normal Goat Serum (Jackson ImmunoResearch Laboratories Code: 005-000-121) 10 mL ddH2O	Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 micrometer syrninge filter. Store aliquots at -20 degrees C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)	To make 100 mL: 25 mL ddH2O 1 mL Tris HCl (1M, pH 7.5) 2.5 g of DABCO solid (CAS: 281-57-9) 3.5 mL 6N HCl 250 uL 10N NaOH 70 mL glycerol	In 250 mL beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 degrees C.
DABCO + p-phenylenediamine (PPD) Solution	1.765 mL NaHCO3 0.353 Na2CO3 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3)	Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 uL of PPD solution to 500 uL of DABCO. Store aliquots at -20 degrees C.
Apple juice plates	To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0) 45 g granulated sugar (store bought) 500 mL Apple juice (store bought) 15 mL Tegosept 10% 1.5 mL ddH2O	Add agar to ddH2O in 4L flask then autoclave for 30 minuntes. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10mL volumes into 35 mm petri dishes and let stand at room temperature to solidfy. Store at 4 degrees C.
Tegosept 10%	To make 100mL: 10g Tegosept 100 mL Ethanol	Store aliquots at -20 degrees C
Yeast paste	~50 g Dry Active Yeast	Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 degrees C.
			Table 2: Staining Materials
DAPI	1:1000	Invitrogen	D3571 //// Stock at 5mg/mL
rabbit anti-Vasa	1:250		A gift from Ruth Lehmann
mouse anti-Fasciclin III	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7G10
mouse anti-1B1	1:4	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1
guniea pig anti-Traffic Jam	1:2500		A gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003)
mouse anti-Prospero	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Prospero MR1A
rat anti-Elav	1:30	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Rat-elav 7EBA10 anti-elav
mouse anti-Repo	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	8D12 anti-Repo
goat anti-rabbit Alexa546	1:500	Invitrogen	A11010
goat anti-mouse Alexa488	1:500	Invitrogen	A11029
goat anti-guniea pig Alexa633	1:500	Invitrogen	A21105
goat anti-rat Alexa488	1:500	Invitrogen	A11006
			Table 3: Materials and Equipment
Fly Cages	Hand-made; Genesee Scientific Corporation	Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101	Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.
Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier	Branson	Model: Branson Digital Sonifier 250
Sonicator Probe	Branson	Model #: 102C (CE)	EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Syringe filter	Nalgene	190-25-20	0.2 micrometer cellulose, acetate membrane filter
Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software	Microscope: Olympus Light source: Lumen Dynamics Camera: Q-Imaging Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.	Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc Light source: X-Cite 120Q Camera: RETIGA-SRV Imaging Software: Slidebook 5.0
Vacuum filter unit	Nalgene	450-0020	0.2 micrometer cellulose nitrate membrane filter