Озвучивание при содействии Иммунофлуоресцентное Окрашивание поздней стадии эмбрионального и личиночного<em> Drosophila</em> Ткани<em> На месте</em

Summary

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Abstract

Исследования, проведенные в Дрозофилы эмбрионов и личинок обеспечивают решающую понимание процессов развития, таких как спецификации клеточных судеб и органогенеза. Иммуноокрашивание позволяет для визуализации развития тканей и органов. Тем не менее, защитная кутикула, что образует в конце эмбриогенеза предотвращает проникновение антител в эмбрионы поздней стадии и личинок. В то время как рассечение до иммунной регулярно используется для анализа дрозофилы личинок тканей, это доказывает, неэффективны для некоторых анализов, потому что маленькие ткани может быть трудно локализовать и изолировать. Озвучивание предоставляет альтернативу вскрытия в личиночной иммуноокрашивания протоколов дрозофилы. Это позволяет быстро, одновременной обработки большого количества зародышей на поздней стадии и личинок и поддерживает на месте морфологии. После фиксации в формальдегид, образец обрабатывают ультразвуком. Образец затем подвергают иммунным окрашиванием с антиген-специфического первичного муравьевibodies и флуоресцентно меченных вторичные антитела визуализировать типы клетки-мишени и специфических белков с помощью флуоресцентной микроскопии. В процессе обработки ультразвуком, правильное размещение ультразвуковую зонда над образцом, а также от длительности и интенсивности ультразвука, имеет решающее значение. ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ незначительные модификации стандартных протоколов иммуноокрашивания могут потребоваться для высоких пятен качества. Для антител с низким отношением сигнал-шум, более длительное время инкубации, как правило, необходимо. Как доказательство концепции для этого протокола обработки ультразвуком при содействии, мы показываем immunostains трех типов тканей (яичках, яичниках и нервной ткани) в диапазоне стадиях развития.

Introduction

Эмбрионы дрозофилы и личинки предоставит прекрасную модель для изучения процессов развития во многих органах и тканях. Визуализация отдельных клеток часто необходимо в этих исследованиях для выяснения сложных условий, в которых клетки развиваются. Визуализация клеток в тканях может быть достигнуто через иммунной окраски. Ну описанных иммуноокрашивания протоколы касаются эмбриональных тканей Drosophila <17 ч после откладки яиц (AEL) ^1-3. Тем не менее, защитные кутикулы формы к концу эмбриогенеза, предотвращая эффективное проникновение антител. Таким образом, эти Иммуноокрашивание протоколы неэффективны при анализе тканей у эмбрионов поздней стадии и на последующих этапах развития личинок ^(1-й возрастной стадии (L1), ^2-й возрастной стадии (L2), и ^3-й возрастной стадии (L3)). Эта неэффективность накладывает барьер для нашего понимания динамических процессов, которые происходят в течение этого длительного периода развития ^4. Tissие рассечение является широко применяется методика, чтобы обойти этот барьер ^5-7. Однако, рассечение может оказаться неэффективным. Добыча может быть обременены трудностями в поиске или выделения эмбриональных и личиночных тканей. Кроме того, физическое удаление ткани-мишени может привести к повреждению путем разрыва их или будучи не в состоянии извлечь их во всей их полноте.

Озвучивание это метод, который использует звуковые волны, чтобы нарушить межмолекулярных взаимодействий. Он был использован нарушить целостность кутикулы личинок Drosophila, чтобы immunostain разработке нейронных типов клеток ^6. Этот протокол был адаптирован для immunostain поздней стадии эмбрионального и личинок половые железы, которые могут быть как малые, как 50 мкм в диаметре ^8-10. С помощью таких исследований, процесс мужской зародышевой линии стволовых клеток (ГСК) формирование ниши был охарактеризован в конце стадии эмбрионов Drosophila ^8-10 и механизмы, регулирующие развитие стволовых клеток и DIFференциации в поздней стадии эмбриональных половых желез и личинок были выяснены ^9-12. Таким образом, обработка ультразвуком обеспечивает эффективную альтернативу рассечения тканей, что может быть трудно, потому что от размера ткани. Кроме того, это позволяет иммунным окрашиванием тканей Drosophila в месте, в результате чего клетки в контексте всего организма и сохранение морфологии на месте. Здесь мы описываем шаг за шагом протокол для флуоресценции иммуноокрашивания поздней стадии эмбрионального через начале / середине L3 тканей в месте. Анализ Drosophila гонадного и нервной ткани показано в Представитель Результаты чтобы продемонстрировать эффективность этого протокола. Кроме того, этот протокол иммунное окрашивание может быть приспособлен для анализа других тканей Drosophila, а также ткани в других организмах с наружным кутикулы.

Protocol

1 Подготовка Collection Кейджем Обезболить молодых, плодородные мух с CO 2. Трансфер наркотизированных мух в клетку. Для получения оптимального выхода, используйте 100-120 взрослых мух, начиная от 2-7 дневного возраста в соотношении 4: 1 самок и самцов. Разрешить летит соответствующий п?…

Representative Results

Для демонстрации эффективности обработки ультразвуком на основе иммуноокрашивания в анализе поздней стадии эмбрионального и тканей личинки в месте, эмбрионы дикого типа и личинки были обработаны для иммуноокрашивания яичек, яичников и нервной ткани. Образцы были обследованы с ?…

Discussion

Этот протокол обеспечивает метод успешно immunostain целевому Drosophila эмбрионального и тканей личинки на месте, тем самым устраняя необходимость для вскрытия. По ранее протоколов для окрашивания ранних эмбрионов ^1,2,3, хорионический мембрану удаляют с помощью 50% отбеливателя (Na…

Materials

			Table 1: Reagents and Buffers
Phosphate Buffer Triton X-100 (PBTx)	For 5 L: 500 mL PBS 10X 4.45 L ddH2O 50 mL Triton 10%	Store at room temperature.
Phosphate Buffer Saline 10x (PBS 10X)	For 1 L in dH2O: 80 g NaCl 2 g KCl 14.4g Na2HPO4 2.4 g KH2PO4	Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 degrees C.
Triton 10%	For 50 mL: 5 mL of Triton 5 mL of PBS 10X 45 mL of ddH2O	Rock to mix. Store at room temperature.
PEMS	0.1 M Pipes (pH 6.9) 2.0 mM MgSO4 1.0 mM EGTA	Store at room temperature.
Pipes	For a 400ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH	Dissolve Pipes in 300 mL dH2Oand then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 mL with dH2O and autoclave. Store at room temperature.
Formaldehyde	37% formaldehyde by weight in methanol	Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Heptane	n-Heptane	CAS 142-82-5. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Methanol	Methanol	CAS 67-56-1. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Phosphate Buffer Tween (PBTw)	To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10%	Filter sterilize after adding all components. Store at 4 degrees C.
Tween 10%	For 50 mL: 5 mL Tween 5 mL of PBS 10X 40 mL of ddH2O	Rock to mix. Store at room temperature.
Bovine Serum Albumin/Phosphate Buffer Tween (BBTw)	To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10% 1 g Bovine Serum Albumin (BSA)	Add BSA then sterilize using a 0.2 micrometer vacuum filter unit. Store at 4 degrees C.
Normal Goat Serum (NGS)	To make 10 mL: Normal Goat Serum (Jackson ImmunoResearch Laboratories Code: 005-000-121) 10 mL ddH2O	Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 micrometer syrninge filter. Store aliquots at -20 degrees C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)	To make 100 mL: 25 mL ddH2O 1 mL Tris HCl (1M, pH 7.5) 2.5 g of DABCO solid (CAS: 281-57-9) 3.5 mL 6N HCl 250 uL 10N NaOH 70 mL glycerol	In 250 mL beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 degrees C.
DABCO + p-phenylenediamine (PPD) Solution	1.765 mL NaHCO3 0.353 Na2CO3 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3)	Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 uL of PPD solution to 500 uL of DABCO. Store aliquots at -20 degrees C.
Apple juice plates	To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0) 45 g granulated sugar (store bought) 500 mL Apple juice (store bought) 15 mL Tegosept 10% 1.5 mL ddH2O	Add agar to ddH2O in 4L flask then autoclave for 30 minuntes. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10mL volumes into 35 mm petri dishes and let stand at room temperature to solidfy. Store at 4 degrees C.
Tegosept 10%	To make 100mL: 10g Tegosept 100 mL Ethanol	Store aliquots at -20 degrees C
Yeast paste	~50 g Dry Active Yeast	Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 degrees C.
			Table 2: Staining Materials
DAPI	1:1000	Invitrogen	D3571 //// Stock at 5mg/mL
rabbit anti-Vasa	1:250		A gift from Ruth Lehmann
mouse anti-Fasciclin III	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7G10
mouse anti-1B1	1:4	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1
guniea pig anti-Traffic Jam	1:2500		A gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003)
mouse anti-Prospero	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Prospero MR1A
rat anti-Elav	1:30	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Rat-elav 7EBA10 anti-elav
mouse anti-Repo	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	8D12 anti-Repo
goat anti-rabbit Alexa546	1:500	Invitrogen	A11010
goat anti-mouse Alexa488	1:500	Invitrogen	A11029
goat anti-guniea pig Alexa633	1:500	Invitrogen	A21105
goat anti-rat Alexa488	1:500	Invitrogen	A11006
			Table 3: Materials and Equipment
Fly Cages	Hand-made; Genesee Scientific Corporation	Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101	Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.
Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier	Branson	Model: Branson Digital Sonifier 250
Sonicator Probe	Branson	Model #: 102C (CE)	EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Syringe filter	Nalgene	190-25-20	0.2 micrometer cellulose, acetate membrane filter
Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software	Microscope: Olympus Light source: Lumen Dynamics Camera: Q-Imaging Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.	Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc Light source: X-Cite 120Q Camera: RETIGA-SRV Imaging Software: Slidebook 5.0
Vacuum filter unit	Nalgene	450-0020	0.2 micrometer cellulose nitrate membrane filter