Beschallung-erleichtert Immunfluoreszenzfärbungen der Late-Stage embryonalen und Larven<em> Drosophila</em> Gewebe<em> In-situ</em

Summary

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Abstract

Studien in Drosophila melanogaster Embryonen durchgeführt und Larven stellen eine wichtige Einblicke in Entwicklungsprozesse wie Zell Schicksal Spezifikation und Organogenese. Immunfärbung ermöglicht die Visualisierung von sich entwickelnden Geweben und Organen. Eine Schutz Kutikula, die am Ende der Embryogenese bildet Jedoch verhindert die Permeation von Antikörpern in der späten Phase Embryonen und Larven. Während Dissektion vor der Immunfärbung wird regelmäßig verwendet werden, um Drosophila Larven Gewebe zu analysieren, erweist es sich als ineffizient für einige Analysen, weil kleine Gewebe kann schwierig sein, zu lokalisieren und zu isolieren. Beschallung stellt eine Alternative zur Dissektion in Larven von Drosophila-Immunfärbung Protokolle. Es ermöglicht die schnelle, gleichzeitige Verarbeitung einer großen Anzahl von Late-Stage-Embryonen und Larven und pflegt in situ Morphologie. Nach Fixierung in Formaldehyd wird eine Probe beschallt. Probe wird dann auf die Immunfärbung mit Antigen-spezifischen primären ant unteribodies und fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper zur Zielzelltypen und bestimmte Proteine ​​über Fluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen. Während des Prozesses der Ultraschallbehandlung ist die richtige Plazierung einer Beschallungssonde über der Probe, sowie die Dauer und die Intensität der Beschallung, kritisch. Für hohe Qualität Flecken können Zusätzliche kleinere Änderungen zur Standard-Immunfärbung Protokolle erforderlich. Antikörper mit niedrigem Signal-Rausch-Verhältnis, in der Regel längere Inkubationszeiten erforderlich. Als Beweis für dieses Konzept Beschallung-Protokoll erleichtert, zeigen wir Immunfärbungen der drei Gewebetypen (Hoden, Eierstöcke, und Nervengewebe) mit einer Reihe von Entwicklungsstufen.

Introduction

Drosophila-Embryonen und Larven bieten ein hervorragendes Modell, um Entwicklungsprozesse in vielen Organen und Geweben zu untersuchen. Imaging von einzelnen Zellen ist notwendig, um die komplexen Umgebungen, in denen Zellen entwickeln oft festzustellen, die in diesen Studien notwendig. Visualisierung von Zellen im Gewebe durch Immunfärbung erreicht werden. Gut beschriebene Immunfärbung Protokolle für embryonale Gewebe Drosophila <17 Stunden nach der Eiablage (AEL) ^1-3 existieren. Jedoch kann eine Schutz Kutikula Formen gegen Ende der Embryogenese und verhindert wirksam Antikörper Permeation. Somit sind diese Immunfärbung Protokolle ineffizient bei der Analyse von Gewebe in der späten Phase Embryonen und in nachfolgenden Stufen der Larvenentwicklung ^(1. Larvenstadium (L1), ^2. Larvenstadium (L2), und ^3. Larvenstadium (L3)). Diese Ineffizienz erlegt eine Barriere, um unser Verständnis der dynamischen Prozesse, die während dieser erweiterten Entwicklungsphase ⁴ auftreten. Tissue Dissektion ist eine weit verwendete Technik, um diese Barriere zu umgehen ^5-7. Allerdings kann Dissektion beweisen ineffizient. Die Extraktion kann durch Schwierigkeiten bei der Lokalisierung oder Isolieren embryonalen und Larvengewebe belastet werden. Darüber hinaus kann die physische Entfernung von Zielgeweben Schäden durch Zerreißen oder sie verstoßen, sie in ihrer Gesamtheit zu extrahieren verursachen.

Ultraschallbehandlung ist ein Verfahren, das die Schallwellen verwendet, um intermolekulare Wechselwirkungen stören. Es wurde verwendet, um die Integrität des Drosophila Larvencuticula um Immunfärbung entwickeln neuronalen Zelltypen ⁶ zu stören. Dieses Protokoll wurde angepasst, um im Spätstadium der embryonalen und Larven Gonaden, die so klein wie 50 um im Durchmesser ^8-10 sein können Immunfärbung. Durch solche Studien hat der Prozess der männlichen Keimbahn-Stammzellen (GSC) Nischenbildung im späten Stadium charakterisiert Drosophila-Embryos ^8-10 und Mechanismen, die der Stammzellentwicklung und difzierung im späten Stadium der embryonalen Keimdrüsen und Larven sind aufgeklärt worden ^9-12. So stellt Beschallung eine effiziente Alternative zu Gewebedissektion die schwierig sein kann, weil der Gewebegröße. Darüber hinaus ermöglicht es die Immunfärbung von Drosophila Gewebe in situ, so dass Zellen im Kontext des Gesamtorganismus und die Aufrechterhaltung in situ Morphologie. Hier beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Fluoreszenz-Immunfärbung von Spätstadium der embryonalen bis Anfang / Mitte L3 Gewebe in situ. Analyse von Drosophila Gonaden und Nervengewebe in den Repräsentative Ergebnisse gezeigt, um die Wirksamkeit dieses Protokoll zu demonstrieren. Weiterhin kann diese Immunofärbungsprotokoll angepasst anderen Drosophila-Gewebe sowie Gewebe in anderen Organismen mit einem äußeren Nagelhaut zu analysieren.

Protocol

1. Herstellung einer Sammlung Cage Betäuben junge, fruchtbare Fliegen mit CO 2. Übertragen betäubten Fliegen auf einen Käfig. Um eine optimale Ausbeute zu erhalten, verwenden Sie 100-120 erwachsenen Fliegen von 2-7 Tagen des Alters bei einem 4: 1-Verhältnis von Frauen zu Männern. Fliegen ermöglichen eine angemessene Eingewöhnungszeit, ~ 24 Stunden vor der Probe für den Erhalt Fixierung. Wenn der Käfig wurde mit jungfräulichen Weibchen gesetzt gepaart, um Männer, eine Verwendung einer 36…

Representative Results

Um die Wirksamkeit von Ultraschall-basierten Immunfärbung in der Analyse von Spätstadium der embryonalen und Larvengewebe in situ zu zeigen, wurden Wildtyp-Embryonen und Larven für Immunfärbung von Hoden, Eierstöcke, und Nervengewebe verarbeitet. Proben wurden mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet und repräsentative Ergebnisse sind dargestellt (Abbildung 1 und Abbildung 2). Ergebnisse zeigen, dass die beschriebenen Protokoll ist während der späten embryonalen bis An…

Discussion

Dieses Protokoll liefert ein Verfahren zur Immunfärbung erfolgreich in situ gezielt Drosophila embryonalen und larvalen Geweben, wodurch die Notwendigkeit für die Präparation. Nach vor-Protokolle für die Färbung frühen Embryonen ^1,2,3 ist der Chorion-Membran mit 50% Bleichmittel (NaOCl) entfernt. Proben werden in Formaldehyd und Methanol fixiert. Weil die Larvencuticula verursacht älteren Probe zu schweben, wird die gesamte Probe dann durch eine Zell-Sieb geleitet, um Larven Retention…

Materials

			Table 1: Reagents and Buffers
Phosphate Buffer Triton X-100 (PBTx)	For 5 L: 500 mL PBS 10X 4.45 L ddH2O 50 mL Triton 10%	Store at room temperature.
Phosphate Buffer Saline 10x (PBS 10X)	For 1 L in dH2O: 80 g NaCl 2 g KCl 14.4g Na2HPO4 2.4 g KH2PO4	Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 degrees C.
Triton 10%	For 50 mL: 5 mL of Triton 5 mL of PBS 10X 45 mL of ddH2O	Rock to mix. Store at room temperature.
PEMS	0.1 M Pipes (pH 6.9) 2.0 mM MgSO4 1.0 mM EGTA	Store at room temperature.
Pipes	For a 400ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH	Dissolve Pipes in 300 mL dH2Oand then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 mL with dH2O and autoclave. Store at room temperature.
Formaldehyde	37% formaldehyde by weight in methanol	Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Heptane	n-Heptane	CAS 142-82-5. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Methanol	Methanol	CAS 67-56-1. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Phosphate Buffer Tween (PBTw)	To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10%	Filter sterilize after adding all components. Store at 4 degrees C.
Tween 10%	For 50 mL: 5 mL Tween 5 mL of PBS 10X 40 mL of ddH2O	Rock to mix. Store at room temperature.
Bovine Serum Albumin/Phosphate Buffer Tween (BBTw)	To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10% 1 g Bovine Serum Albumin (BSA)	Add BSA then sterilize using a 0.2 micrometer vacuum filter unit. Store at 4 degrees C.
Normal Goat Serum (NGS)	To make 10 mL: Normal Goat Serum (Jackson ImmunoResearch Laboratories Code: 005-000-121) 10 mL ddH2O	Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 micrometer syrninge filter. Store aliquots at -20 degrees C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)	To make 100 mL: 25 mL ddH2O 1 mL Tris HCl (1M, pH 7.5) 2.5 g of DABCO solid (CAS: 281-57-9) 3.5 mL 6N HCl 250 uL 10N NaOH 70 mL glycerol	In 250 mL beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 degrees C.
DABCO + p-phenylenediamine (PPD) Solution	1.765 mL NaHCO3 0.353 Na2CO3 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3)	Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 uL of PPD solution to 500 uL of DABCO. Store aliquots at -20 degrees C.
Apple juice plates	To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0) 45 g granulated sugar (store bought) 500 mL Apple juice (store bought) 15 mL Tegosept 10% 1.5 mL ddH2O	Add agar to ddH2O in 4L flask then autoclave for 30 minuntes. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10mL volumes into 35 mm petri dishes and let stand at room temperature to solidfy. Store at 4 degrees C.
Tegosept 10%	To make 100mL: 10g Tegosept 100 mL Ethanol	Store aliquots at -20 degrees C
Yeast paste	~50 g Dry Active Yeast	Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 degrees C.
			Table 2: Staining Materials
DAPI	1:1000	Invitrogen	D3571 //// Stock at 5mg/mL
rabbit anti-Vasa	1:250		A gift from Ruth Lehmann
mouse anti-Fasciclin III	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7G10
mouse anti-1B1	1:4	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1
guniea pig anti-Traffic Jam	1:2500		A gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003)
mouse anti-Prospero	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Prospero MR1A
rat anti-Elav	1:30	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Rat-elav 7EBA10 anti-elav
mouse anti-Repo	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	8D12 anti-Repo
goat anti-rabbit Alexa546	1:500	Invitrogen	A11010
goat anti-mouse Alexa488	1:500	Invitrogen	A11029
goat anti-guniea pig Alexa633	1:500	Invitrogen	A21105
goat anti-rat Alexa488	1:500	Invitrogen	A11006
			Table 3: Materials and Equipment
Fly Cages	Hand-made; Genesee Scientific Corporation	Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101	Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.
Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier	Branson	Model: Branson Digital Sonifier 250
Sonicator Probe	Branson	Model #: 102C (CE)	EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Syringe filter	Nalgene	190-25-20	0.2 micrometer cellulose, acetate membrane filter
Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software	Microscope: Olympus Light source: Lumen Dynamics Camera: Q-Imaging Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.	Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc Light source: X-Cite 120Q Camera: RETIGA-SRV Imaging Software: Slidebook 5.0
Vacuum filter unit	Nalgene	450-0020	0.2 micrometer cellulose nitrate membrane filter