הקל Sonication Immunofluorescence הכתמה של שלב מאוחר עוברי וזחל<em> דרוזופילה</em> רקמות<em> באתר</em

Summary

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Abstract

מחקרים שבוצעו בתסיסנית עוברים וזחלים מספקים תובנה חיונית לתהליכים התפתחותיים כגון מפרט גורל התא וorganogenesis. Immunostaining מאפשר ההדמיה של פיתוח רקמות ואיברים. עם זאת, לציפורן הגנה שיוצרת בסופו של עובר מונעת חלחול של נוגדנים לעוברי בשלב מאוחר וזחלים. בעוד לנתיחה לפני immunostaining משמשת באופן קבוע לנתח רקמות זחל דרוזופילה, זה מוכיח לא יעיל עבור חלק ניתוחים בגלל רקמות קטנות עשויות להיות קשות לאתר ולבודד. Sonication מספק חלופה לנתיחה בפרוטוקולי immunostaining דרוזופילה זחל. זה מאפשר עיבוד מהיר, בו זמני של מספר הגדול של עוברים בשלב מאוחר וזחלים ושומר במורפולוגיה באתר. לאחר הקיבוע בפורמלין, מדגם sonicated. לדוגמא נתונה אז immunostaining עם נמלה העיקרית אנטיגן ספציפיibodies ונוגדנים משני שכותרתו fluorescently לדמיין סוגי תאי היעד וחלבונים ספציפיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. במהלך התהליך של sonication, מיקום נכון של בדיקה sonicating מעל המדגם, כמו גם את המשך ועוצמת sonication, הוא קריטי. שינויים קלים additonal לפרוטוקולי immunostaining סטנדרטיים עשויים להידרש לכתמים באיכות גבוהות. לנוגדנים עם אות נמוכה יחס רעש, פעמים דגירה ארוכות יותר הן בדרך כלל צורך בכך. כהוכחה של קונספט לפרוטוקול הקל sonication זה, אנו מראים immunostains של שלושה סוגי רקמות (אשכים, השחלות, ורקמות עצביות) בטווח של שלבי התפתחות.

Introduction

עוברי דרוזופילה וזחלים מספקים מודל מצוין ללמוד תהליכים התפתחותיים באיברים ורקמות רבים. הדמיה של תאים בודדים היא לעתים קרובות יש צורך במחקרים אלה על מנת לוודא הסביבות המורכבות שבו תאים לפתח. ויזואליזציה של תאים ברקמות יכולה להיות מושג באמצעות immunostaining. ובכן תיאר immunostaining פרוטוקולים קיימים לרקמות עוברי דרוזופילה <17 שעות לאחר הטלת ביצים (AEL) ^1-3. עם זאת, צורות מגן ציפורן לקראת הסוף של עובר, מניעת חלחול נוגדן יעיל. לפיכך, פרוטוקולי immunostaining אלה אינם יעילים בניתוח של רקמות בעוברים בשלב מאוחר ובשלבים מאוחרים יותר של התפתחות זחל (instar 1 ^st (L1), instar 2 ^nd (L2), ו3 instar ^rd (L3)). חוסר יעילות זה מטיל מחסום להבנה של תהליכים דינמיים המתרחשים בתקופה התפתחותית מורחבת זה ^4. Tissנתיחת ue היא טכניקה מועסק נרחב לעקוף מכשול זה ^5-7. עם זאת, לנתיחה יכולה להוכיח לא יעילה. חילוץ ניתן לשעבוד על ידי קושי באיתור או בידוד עוברי ורקמות זחל. יתר על כן, ההסרה הפיסית של רקמות היעד עלולה לגרום נזק על ידי פקיעתם או בכך שלא לחלץ אותם בשלמותם.

Sonication הוא שיטה שמעסיקה גלי קול להפריע אינטראקציות מולקולאריים. זה כבר נעשה שימוש כדי לשבש את שלמות ציפורן זחל תסיסנית כדי immunostain פיתוח סוגי תאים עצביים ^6. פרוטוקול זה הותאם לimmunostain עוברי בשלב מאוחר ובלוטות מין זחל, אשר יכול להיות קטנה כמו 50μm בקוטר ^8-10. באמצעות מחקרים כאלה, התהליך של תאי גזע בתאי מין היווצרות נישה גברית (GSC) התאפיין בשלב מאוחר עוברי דרוזופילה ^8-10 ומנגנוני ויסות התפתחות תאי גזע וDIFferentiation בבלוטות מין עוברי בשלב מאוחר וזחלים כבר הובהר ^9-12. לפיכך, sonication מספק אלטרנטיבה יעילה לנתיחת רקמות שעלולות להיות קשה בגלל גודל של רקמה. יתר על כן, היא מאפשרת immunostaining של רקמות דרוזופילה באתר, עוזב תאים בהקשר של הגוף כולו ושמירה במורפולוגיה באתר. כאן, אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד לimmunostaining הקרינה של עוברי בשלב מאוחר עד תחילת / רקמות אמצע-L3 באתר. ניתוח של רקמת אשכים ועצביים דרוזופילה מוצג בנציג התוצאות כדי להדגים את היעילות של פרוטוקול זה. יתר על כן, פרוטוקול immunostaining זה עשוי להיות מותאם לנתח רקמות אחרות דרוזופילה, כמו גם רקמות באורגניזמים אחרים עם עור מת חיצוני.

Protocol

.1 הכנת קייג אוסף הרדימי זבובים צעירים, פורה עם CO 2. העבר את הזבובים מורדמים לכלוב. כדי להשיג תשואה אופטימלית, להשתמש 100-120 זבובים בוגרים נעים בין 2-7 ימים של גיל ב4: 1 יחס של נקבות לזכרים. לאפשר זבובי תקופת הסתגלות מתאי…

Representative Results

כדי להדגים את היעילות של immunostaining מבוסס sonication בניתוח עוברי בשלב מאוחר וברקמות זחל באתר, עוברי wild-type וזחלים עובדו לimmunostaining של אשכים, השחלות, ורקמה עצבית. דגימות הם צילמו באמצעות מיקרוסקופיה confocal ותוצאות נציג מוצגות (איור 1 ואיור 2). תוצאות עולות כי הפרוטוקו…

Discussion

פרוטוקול זה מספק שיטה להצלחת immunostain למקד דרוזופילה עוברית ורקמות זחל באתר, ובכך מבטל את הצורך בנתיחה. לפי פרוטוקולים לפני מכתים עוברים המוקדמים ^1,2,3, קרום כוריוני מוסר באמצעות אקונומיקה 50% (NaOCl). דגימות קבועות בפורמלין ומתנול. בגלל ציפורן הזחל גורמת מדגם…

Materials

			Table 1: Reagents and Buffers
Phosphate Buffer Triton X-100 (PBTx)	For 5 L: 500 mL PBS 10X 4.45 L ddH2O 50 mL Triton 10%	Store at room temperature.
Phosphate Buffer Saline 10x (PBS 10X)	For 1 L in dH2O: 80 g NaCl 2 g KCl 14.4g Na2HPO4 2.4 g KH2PO4	Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 degrees C.
Triton 10%	For 50 mL: 5 mL of Triton 5 mL of PBS 10X 45 mL of ddH2O	Rock to mix. Store at room temperature.
PEMS	0.1 M Pipes (pH 6.9) 2.0 mM MgSO4 1.0 mM EGTA	Store at room temperature.
Pipes	For a 400ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH	Dissolve Pipes in 300 mL dH2Oand then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 mL with dH2O and autoclave. Store at room temperature.
Formaldehyde	37% formaldehyde by weight in methanol	Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Heptane	n-Heptane	CAS 142-82-5. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Methanol	Methanol	CAS 67-56-1. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Phosphate Buffer Tween (PBTw)	To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10%	Filter sterilize after adding all components. Store at 4 degrees C.
Tween 10%	For 50 mL: 5 mL Tween 5 mL of PBS 10X 40 mL of ddH2O	Rock to mix. Store at room temperature.
Bovine Serum Albumin/Phosphate Buffer Tween (BBTw)	To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10% 1 g Bovine Serum Albumin (BSA)	Add BSA then sterilize using a 0.2 micrometer vacuum filter unit. Store at 4 degrees C.
Normal Goat Serum (NGS)	To make 10 mL: Normal Goat Serum (Jackson ImmunoResearch Laboratories Code: 005-000-121) 10 mL ddH2O	Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 micrometer syrninge filter. Store aliquots at -20 degrees C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)	To make 100 mL: 25 mL ddH2O 1 mL Tris HCl (1M, pH 7.5) 2.5 g of DABCO solid (CAS: 281-57-9) 3.5 mL 6N HCl 250 uL 10N NaOH 70 mL glycerol	In 250 mL beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 degrees C.
DABCO + p-phenylenediamine (PPD) Solution	1.765 mL NaHCO3 0.353 Na2CO3 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3)	Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 uL of PPD solution to 500 uL of DABCO. Store aliquots at -20 degrees C.
Apple juice plates	To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0) 45 g granulated sugar (store bought) 500 mL Apple juice (store bought) 15 mL Tegosept 10% 1.5 mL ddH2O	Add agar to ddH2O in 4L flask then autoclave for 30 minuntes. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10mL volumes into 35 mm petri dishes and let stand at room temperature to solidfy. Store at 4 degrees C.
Tegosept 10%	To make 100mL: 10g Tegosept 100 mL Ethanol	Store aliquots at -20 degrees C
Yeast paste	~50 g Dry Active Yeast	Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 degrees C.
			Table 2: Staining Materials
DAPI	1:1000	Invitrogen	D3571 //// Stock at 5mg/mL
rabbit anti-Vasa	1:250		A gift from Ruth Lehmann
mouse anti-Fasciclin III	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7G10
mouse anti-1B1	1:4	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1
guniea pig anti-Traffic Jam	1:2500		A gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003)
mouse anti-Prospero	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Prospero MR1A
rat anti-Elav	1:30	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Rat-elav 7EBA10 anti-elav
mouse anti-Repo	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	8D12 anti-Repo
goat anti-rabbit Alexa546	1:500	Invitrogen	A11010
goat anti-mouse Alexa488	1:500	Invitrogen	A11029
goat anti-guniea pig Alexa633	1:500	Invitrogen	A21105
goat anti-rat Alexa488	1:500	Invitrogen	A11006
			Table 3: Materials and Equipment
Fly Cages	Hand-made; Genesee Scientific Corporation	Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101	Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.
Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier	Branson	Model: Branson Digital Sonifier 250
Sonicator Probe	Branson	Model #: 102C (CE)	EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Syringe filter	Nalgene	190-25-20	0.2 micrometer cellulose, acetate membrane filter
Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software	Microscope: Olympus Light source: Lumen Dynamics Camera: Q-Imaging Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.	Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc Light source: X-Cite 120Q Camera: RETIGA-SRV Imaging Software: Slidebook 5.0
Vacuum filter unit	Nalgene	450-0020	0.2 micrometer cellulose nitrate membrane filter