Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

שריר חלק בשלפוחית ​​השתן רצועת התכווצות כשיטה להערכת נמוכה יותר בדרכי שתן פרמקולוגיה

Published: August 18, 2014 doi: 10.3791/51807
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,2
1Department of Medicine, Renal division, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

כתב יד זה מציג פשוט, אך רב עוצמה, בשיטה חוץ גופית להערכת התכווצות שריר חלק בתגובה לסוכנים תרופתיים או גירוי עצב. יישומים עיקריים הם הקרנת סמים ופיזיולוגיה רקמת הבנה, פרמקולוגיה, ופתולוגיה.

Abstract

אנו מתארים שיטה במבחנה למדידת התכווצות שריר חלק בשלפוחית ​​השתן, ושימוש בו לחקירת מאפיינים פיסיולוגיים ותרופתיים של שריר החלק, כמו גם שינויים הנגרמים על ידי פתולוגיה. שיטה זו מספקת מידע קריטי להבנת תפקוד שלפוחית ​​השתן תוך כדי התגברות על קשיים גדולים מתודולוגיים נתקלו בניסויי vivo, כגון מניפולציות כירורגית ותרופתיות המשפיעות על יציבות והישרדות של ההכנות, שימוש ברקמות אנושיות, ו / או שימוש בכימיקלים יקרים. הוא גם מספק דרך לחקור את המאפיינים של כל מרכיב בשלפוחית ​​השתן (כלומר שריר חלק, רירית, בעצבים) בתנאים בריאים ופתולוגי.

שלפוחית ​​השתן הוא להסיר חיה הרדים, להציב פתרון קרבס וחתוך לרצועות. רצועות ממוקמות לתוך תא מלא בפתרון קרבס חם. קצה אחד מחובר לtensio איזומטרימתמר n למדוד כוח התכווצות, בקצה השני מחובר למוט קבוע. רקמה היא מגורה על ידי ישירות הוספת תרכובות באמבטיה או על ידי אלקטרודות גירוי שדה חשמליות המפעילות את עצבים, בדומה למפעיל התכווצויות שלפוחית ​​in vivo. אנו מדגימים את השימוש בשיטה זו על מנת להעריך התכווצות שריר חלק ספונטנית במהלך פיתוח, ולאחר פגיעה בחוט השדרה ניסיונית, הטבע של עצבית (משדרים וקולטנים מעורבים), גורמים מעורבים בויסות של פעילות שריר חלק, התפקיד של רכיבי שלפוחית ​​בודדים, ומינים והבדלי איבר בתגובה לסוכנים תרופתיים. בנוסף, הוא יכול לשמש לחקר מסלולים תאיים מעורבים בהתכווצות ו / או הרפיה של שריר החלק, יחסי מבנה פעילות תרופה והערכה של שחרור משדר.

שיטת התכווצות שריר חלק במבחנה כבר נעשה שימוש נרחב FOr מעל 50 שנים, וספק נתונים שתרמו באופן משמעותי להבנה של תפקוד שלפוחית ​​שלנו, כמו גם לפיתוח תרופות של תרכובות המשמשות כיום מבחינה קלינית לניהול שלפוחית ​​השתן.

Introduction

שריר החלק בשלפוחית ​​השתן נרפה כדי לאפשר אחסון שתן, וחוזים לעורר חיסול שתן. הרפיה מתווכת על ידי תכונות שריר חלק פנימיות ועל ידי שחרור טוניק של נוראפינפרין (NE) מהעצבים הסימפתטית, אשר מפעיל קולטני בטא adrenergic (β 3 AR באדם) בdetrusor. רקה מושגת על ידי עיכוב הקלט האוהד והפעלת העצבים הפאראסימפתטית שישחררו ACH / ATP להתכווץ שריר החלק בשלפוחית ​​השתן 1. תנאים רבים פתולוגיים, כולל מוח ו / או פגיעה בחוט השדרה, מחלות ניווניות, סוכרת, חסימת מוצא שלפוחית ​​השתן או דלקת שלפוחית ​​השתן interstitial, יכולים לשנות את תפקוד שלפוחית ​​השתן עמוק, עם השלכות קשות על איכות חיים של המטופל 2. תנאים אלה לשנות את ההתכווצות של שריר החלק על ידי המשפיע על אחד או יותר מרכיבים של שלפוחית ​​השתן: שריר החלק, מביא או עצבי efferent ו / אורירית.

כמה in vivo ובשיטות מבחנה ללמוד תפקוד שלפוחית ​​השתן פותחו. בvivo, cystometry הוא המדידה הראשונית של תפקוד שלפוחית ​​השתן. למרות זאת היא הכנה שלמה המאפשרת איסוף מידע במסגרת קרובה לתנאים פיסיולוגיים, יש מספר הנסיבות שבהן השימוש ברצועות שריר חלק הוא מועדפת. אלה כוללים מצבים שבם וכירורגי / או מניפולציות תרופתי ישפיעו על ההישרדות והיציבות של הכנת in vivo, או כאשר המחקרים דורשים שימוש ברקמה האנושית או כימיקלים יקרים. שיטה זו גם מאפשרת בדיקה של ההשפעות של תרופות, גיל ופתולוגיה בכל רכיב של שלפוחית ​​השתן, כלומר שריר חלק, רירית, מביא ועצבי efferent.

רצועות שלפוחית ​​כבר מועסקות במשך השנים על ידי קבוצות רבות לענות על מספר שאלות מדעיות. הם היו רגילים לevaשינויי luate בפעילות ספונטנית myogenic הנגרמים על ידי פתולוגיה. הוא האמין כי פעילות זו תורמת לתסמיני דחיפות ותכיפות של פעילות יתר של שלפוחית ​​(OAB), ולכן הוא יעד לתרופות שפותחו עבור OAB 3-9. רצועות שלפוחית ​​השתן שמשו גם כדי לחקור גורמי myogenic ועצביים המווסתים את טונוס שרירים חלק במטרה לגלות תעלות יונים ו / או קולטנים ו / או מסלולים תאיים שיכול להיות ממוקדת כדי לגרום או הרפיה או התכווצות של שריר חלק 3,10- 13. מחקרים אחרים התמקדו בטבע של עצבית, כולל משדרים וקולטנים המעורבים ושינויים הנגרמים על ידי פתולוגיה 14,15. בנוסף, השיטה הייתה בשימוש להשוואה בין רקמות ממינים שונים 16- 18, בין האיברים 19-21, והערכה של מערכות יחסים מבנה פעילות תרופת 22-24. סיומת של שיטה זו נעשתה שימוש כדי measurדואר את ההשפעה של תרופות על שחרור משדר מעצבי efferent 25. יתר על כן, מגוון רחב של רקמות (שלפוחית ​​השתן, שופכה, מערכת עיכול, במערכת העיכול) שנקטפו מבעלי חיים או בני אדם (מניתוחים או רקמת תורם איברים שאושרו למחקר) וממגוון רחב של מודלים של בעלי חיים, כולל פגיעה בחוט השדרה (SCI), חסימת מוצא שלפוחית ​​השתן (BOO), או דלקת שלפוחית ​​השתן interstitial (IC) יכול להיחקר שימוש בטכניקה זו.

במאמר זה אנו מציגים את השימוש בשיטה זו יחד עם פרוטוקולי ניסוי הכרחיים, כדי לטפל בכמה שאלות מדעיות שהוזכרו לעיל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הנהלים שתוארו כאן אושרו על ידי ועדת IACUC באוניברסיטת פיטסבורג.

.1 פתרונות

  1. הכן פתרון קרבס על פי המתכון. הרכב במ"מ: 118 NaCl, KCl 4.7, CaCl 2 1.9, 4 MgSO 1.2, NaHCO 3 24.9, KH 2 PO 4 1.2, דקסטרוז 11.7.
  2. לאוורר קרבס עם 95% O 2, 5% CO 2 ולמקם אותו באמבט 37 ºC מים לשימוש לאורך כל הניסוי. מניחים בצד ~ 200 מ"ל של תמיסת קרבס סודה בטמפרטורת חדר שישמש לנתיחת רקמות.
  3. למדוד pH (~ 7.4) וosmolarity (~ 300 mOsm) של קרבס סודה.

.2 ניסויי Set-up (איור 1 א סכמטי)

  1. מלא סודה (95% O 2, 5% CO 2) תאים עם 10 מ"ל קרבס.
  2. התחל משאבת מים במחזור כדי לחמם את התאים ל37 ° C; מגבר (ים), ממריץ (: להפעיל את הציוד הדרושתוכנת ים) והקלטה.
  3. לכייל מתמרים עם משקל 1 גרם.

.3 רקמות (איור 1)

הסר את שלפוחית ​​השתן מעכברוש ספראג Dawley נשי נאיבי מבוגר (200-250 גר '; ~ 10-12 שבועות) ביצוע השלבים הבאים:

  1. הכינו אזור לנתיחה ומכשירים דרושים: סכיני גילוח חשמליים, מלקחיים עם שיניים, להב סכין מנתחים, מספריים לנתח, microscissors, שני מלקחיים לנתח (מחברים מעדיפים דומון # מלקחיים 3), קטעי רקמה (או תפר משי), צלחת לנתיחה Sylgard מצופה בקרבס ו סיכות לנתיחה רקמות.
  2. להרדים את החיה עם שאיפת isoflurane (4% בO 2) בחדר האינדוקציה. השתמש במשחת טרינריים המשפיעה על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. לפקח באופן רציף את רמת ההרדמה על ידי התבוננות קצב הנשימה, תגובה לגירויים חיצוניים, ואובדן של איבר אחורי לסגת רפלקס.
  3. כאשר בעל החיים הוא מורדמים גילוח הבטן התחתונהמחשבה. לחשוף את אברי האגן דרך חתך בבטן קו האמצע. זהה את שלפוחית ​​השתן ושופכה. הסר את שלפוחית ​​השתן על ידי חיתוך בצוואר שלפוחית ​​השתן בסמוך לשופכה הפרוקסימלית. הנח רקמה מייד בצלחת המצופה Sylgard מלא פתרון קרבס סודה.
  4. במידת הצורך, להסיר רקמה נוספת בשלב זה: שופכה, חתיכות של מערכת עיכול (GI) ו / או ערמונית, וכו '
  5. להקריב בעלי החיים תוך שימוש בשיטות שאושרו IACUC (למשל, מנת יתר הרדמה או חנק CO 2 ואחריו שיטה משנית).
  6. הכנס סיכות רקמה לנתח דרך כיפת שלפוחית ​​השתן, צוואר, והשופכנים, כדי לייצב את הרקמות לנתיחה נוספת. לא למתוח את הרקמה. הסרה של רקמת שומן, חיבור, שופכה הפרוקסימלית, והשופכנים אם קיימים.
  7. פתח את שלפוחית ​​השתן מהבסיס לכיפה כדי ליצור גיליון שטוח, צד serosa למטה / צד עד luminal (איור 1). הנח סיכות לנתח בכל פינה של הרקמה. הסר dom שלפוחית ​​השתןדואר ורקמות צוואר.
  8. אם מטרת הניסוי היא לקבוע את התרומה של הרירית (urothelium וpropria lamina - ראה תרשים איור 1 ג) להתכווצות שריר החלק, להשוות את המאפיינים של רצועות detrusor עם ובלי הרירית המצורפת. לשם כך, לפני חיתוך הרקמה ברצועות, להסיר בזהירות את השכבה הרירית באמצעות קשתית אביב מספריים ומלקחיים עדינים תחת מיקרוסקופ לנתח. בסופו של הניסוי, לתקן את הרצועות לצביעת H & E כדי לאשר את הסרת הרירית שלמה. שים לב שהליך זה הוא קל יותר בשלפוחית ​​שתן עכבר מאשר בשלפוחית ​​השתן של חולדה.
  9. חותך את הרקמה לאורך מבסיס לכיפה לרצועות של ~ 2 x 8 מ"מ (איור 1). לקשור או לצרף סרטון רקמה בשני הקצוות של כל רצועה.
    הערה: שלפוחית ​​השתן של חולדה אחת בדרך כלל ניתן לחתוך לרצועות 4 אך מספר הרצועות יכול לגדול או לקטון בהתאם לגודל חיה / שלפוחית ​​השתן.
  10. העבר את הרצועות לexperתאי imental. חבר קצה אחד של כל רצועה למתמר כוח, אשר מודד את התכווצות הרקמה, והשני למוט זכוכית / מתכת קבועה.
    הערה: תאי רקמות שונים בגודלם (0.2 מ"ל ל20 מ"ל או גדול יותר). תאים אופייניים לשלפוחיות מכרסמים הם 5-20 מ"ל, המספק גובה מספיק לרצועות להיות טבלו לגמרי בפתרון. תאים מסוימים מגיעים עם מובנה באלקטרודות גירוי, אחרים לא. יש להקפיד על מנת להבטיח כי כל החיבורים של אלקטרודות נמצאים במצב טוב, אחרת גירוי שדה חשמלי הוא לא אמין.
  11. למרוח כמות מוגדרת של כוח לכל רצועה בעדינות על ידי מתיחת הרקמה עד מתח בסיסי מגיע g 1 (~ 10 MN). בתחילה הרקמות נוטה להירגע אשר נרשמו כירידה במתח בנקודת ההתחלה. רקמה לשטוף בערך כל דקות 15 באמצעות קרבס סודה החם ולהתאים את המתח הבסיסי ל1 גרם לאחר כל שטיפה. לאפשר רקמה לאזן ל~ 1-2 שעה או עד שהמתח בנקודת ההתחלה הוא יציב (כלומר הרפיה רקמה לא יותר).
  12. הוא הגיע כדאיות רקמות בדיקה על ידי הוספת KCl (80 מ"מ) ישירות לאמבטיה ל~ 5 דקות, או עד שתגובת רמה. תגובות לריכוזים גבוהים של KCl גם ניתן לחזור במהלך הניסוי או בסוף הניסוי ומשמשות לנרמול תגובות לתרופות אחרות או בין רצועות (ראה נורמליזציה לפי סעיף ניתוח נתונים).
  13. פעמים רקמה לשטוף מרובות (3-5x) עם קרבס סודה החם כדי לאפשר לרקמות לחזור למראש טיפול תנאים.

.4 גירוי פרוטוקולים

  1. כדי לחקור את ההשפעות של פתולוגיה בפעילות myogenic ספונטנית או טונוס שרירים חלק, להשתמש ברצועות שריר חלק ממודלים של בעלי חיים שונים כגון SCI, BOO, או ילודים. איור 2 מדגים את השימוש בשיטה זו כדי לחקור את השינויים בפעילות ספונטנית בשלפוחית ​​השתן במהלך פיתוח ו לאחר SCI. בנוסף, ניתן להשתמש בסוכנים תרופתיים לווסת spontaneous פעילות. איור 3 ממחיש את ההשפעה של מאפנני KCNQ ערוץ, flupirtine וXE991, על פעילות ספונטנית וטונוס שרירים חלק.
  2. לעקומות תרופתי חלקות מבנה גירוי שרירים תגובת ריכוז על ידי הוספת תרכובות מפתרונות מניות מרוכזות ישירות לאמבטיה במרווחי זמן מוגדר. השתמש בסמים וברכב ברצועות מקבילות לדין וחשבון על השפעות רכב והזמן.
    1. הפוך פתרונות מניות של תרכובות מבחן רצויים ב1000x ריכוז העבודה הסופי. לcarbachol (CCH), אגוניסט קולטן מוסקריניים, להכין המניות הבאות: 10 -5 M, 3 x 10 -5 M, 10 -4 M, 3 x 10 -4 M, 10 -3 M, 3 x 10 -3 M , 10 -2 מ ' ריכוזים סופי באמבטיה הוא 10 -8 M ל10 -5 M (4C דמויות, D). לneuromedin B (NMB), אגוניסט תת סוג 1 קולט bombesin, להכין המניות הבאות: 10 -8 M, 10 -7M, 10 -6 M, 10 -5 M, 10 -4 M, 10 -3 M וריכוזים סופיים באמבטיה הם 10 -11 M ל10 -6 מ ' שני CCH וNMB צפויים להגדיל התכווצות רקמה.
    2. לאמבטיה רקמות 10 מ"ל, להוסיף 10 μl של כל פתרון מניות CCH בהקדם התגובה מגיעה לרמה (איור 4C, D). ברצועות מקבילות להוסיף כמויות שווה של הרכב (מים). בדומה לכך, להוסיף 10 μl של כל פתרון B מניית neuromedin כל דקות ~ 5.
      הערה: שים לב לאפקט מעורר של NMB וCCH על טונוס שרירים חלק ברצועות ממינים שונים באיור 4.
    3. לחקור את תכונות ההרפיה של השרירים החלקים ברקמות נדבקו מראש עם סוכן מעורר, בדרך כלל CCH או KCl.
    4. כדי לחסום תגובת אגוניסט, pretreat הרקמה ל10-20 דקות עם היריב כדי לאפשר חדיר לרקמות, לפני אגוניסט גירוי.
  3. לסטים עצבייםulation של שריר החלק, גירוי שדה חשמלי הנקרא גם (EFS) בצע את פעולות 1-3.13 ולהמשיך כמתואר בהמשך. EFS נועד להפעיל באופן סלקטיבי עצבים לעומת שריר חלק. פרמטרים לגירוי צריכים להיות שנבחרו בקפידה, כדי למנוע גירוי שריר חלק ישיר.
    1. לקבוע פרמטרים גירוי: סוג של גירוי (פולסים בודדים או רכבות), משך (משך דופק ומשך רכבת), תדירות ועוצמה, כפי שמתוארים בשלבים הבאים ומאויר באיורים 5A, B.
      1. לגירוי אחד הדופק, משך דופק סט, מרווח בין גירוי ומספר הגירויים הרצויים. פרמטרים משך גירוי רגילים הם פולסים בודדים של .05-0.3 משך אלפיות שני נמסר במרווחים רצויים (איור 5 א). בצע צעד 4.3.1.4 לעוצמת גירוי.
      2. לגירוי רכבת, להגדיר את משך זמן רכבת ומרווח רכבת היתר. ערכים אופייניים לרקמת השלפוחית ​​3-10 שניות נמסרו מ 'לפחות 1בזה מזה (איור 5). אם עייפות רקמות מתרחשת (כלומר EFS התכווצויות לרדת במהלך תקופת ביקורת), הגדל את המרווח בין הרכבת.
      3. להקים את התדר של גירויי רכבת (מספר הפעימות ברכבת - איור 5 ב). הפעל עקומת תגובת תדר נעה 0.5-50 הרץ. תדרים אופייניים לשלפוחית ​​שתן הם 10-20 הרץ, אשר נותן התכווצויות לשחזור ויציבים בתיווכה של ATP וACH. שים לב לתגובות התדירות תלויות לגירוי EFS ברצועות שלפוחית ​​השתן עכבר באיור 5 מדגימים כיצד שיטה זו יכולה לשמש כדי להעריך את התרומה של הכולינרגית ומנגנוני purinergic להעברה עצבית.
      4. להקים עוצמת הגירוי: באופן שיטתי להגביר את עוצמת (מתח) של הגירוי עד המשרעת של ההתכווצות מגיעה לרמה (אם רכבות באמצעות לשמור קבועות בתדר).
      5. הגדר את עוצמת הגירוי בהתאםמטרה של הניסוי. אם המטרה היא להגדיל את ההתכווצויות עוררות העצביות, ולאחר מכן להשתמש בעוצמה submaximal כך שהמשרעת של התכווצות היא ~ 50% מהתכווצות מקסימלי. אם המטרה היא להפחית את ההתכווצויות עוררות העצביות, ולאחר מכן קבע את עוצמת ל~ 80% ממשרעת המרבית כדי למנוע עייפות רקמה.
    2. ברגע שפרמטרי גירוי (משך, תדירות ועוצמה) הם הקימו, לאפשר ~ 20-30 דקות לEFS- עוררו התכווצויות לייצב לפני בדיקות סמים.
      הערה: כדי לאמת את הסלקטיביות של EFS להעברה עצבית, הולכה עצבית בלוק עם חוסם Na + הערוץ, tetrodotoxin (TTX; 0.5-1 מיקרומטר). לבצע שלב זה בתחילת הניסוי, כTTX שוטף קל יחסית. בנוסף, לבצע את זה בסופו של הניסוי (ראה שלב 4.3.5. להלן).
    3. הכן פתרונות מניות ב1,000x ריכוזי עבודה הסופיים ל: אלפא, ביתא ATP-תילן (ABMA; activator קולט purinergicוdesensitizer) 10 -2 M, אטרופין (אנטגוניסט לרצפטור מוסקריניים) 10 -3 M (איור 5 ג). שים לב דוגמאות אחרות באיור 6. אגוניסט קולטן 5HT4, cisapride (3 x 10 -6 M, 10 -6 M, x 3 x 10 -5 M, 10 -5 M, 3 10 -4 M, 10 -4 M, 3 x 10 -3 M, 10 -3 M), מגביר התכווצות רקמות וSB-203,186 (3 x 10 -3 M), אנטגוניסט לרצפטור 5HT4, הופך השפעות של cisapride.
    4. כדי לבחון את ההשפעות של ABMA ואטרופין על EFS (איור 5 ג), לבצע שתי עקומות תגובת תדר שליטה. הוסף 10 μl של 10 -2 M ABMA לאמבטיה לריכוז סופי של 10 מיקרומטר. זה יהיה חוזה הרקמות עקב גירוי ישיר של רצפטורים purinergic בשריר החלק. לאחר תשואות התגובה לנקודת התחלה, לחזור על עקומות תגובת תדר. הוסף 10 μl של 10 -3 אטרופין M לתרכיזים סופייםיון של 1 מיקרומטר. לאחר 10 דקות ~ (נדרשו עבור אטרופין לחסום קולטני מוסקריניים), עקומות תגובת תדר חוזרות. ברצועות מקבילות להוסיף 10 μl של הרכב, מים, בכל שלב.
      הערה: לקבלת דוגמאות אחרות באיור 6, להוסיף 10 μl של כל פתרון מניות cisapride במרווחי זמן מוגדר זמן (~ כל 15 דקות; ראו דיון), ואחריו 10 μl של פתרון מניות SB-203,186 ישירות לאמבטיה ולפקח על ההשפעה שלהם על EFS-induced התכווצות. ברצועות מקבילות להוסיף 10 μl של הרכב, DMSO. שים לב להשפעות של cisapride, אגוניסט קולטן 5HT4, על התכווצויות עוררו EFS ברקמות שלפוחית ​​השתן ומעי אנושיים באיור 6. בנוסף, לבחון את ההשפעה של DMSO, הרכב לcisapride, על התכווצויות עוררות EFS בשלפוחית ​​שתן אנושי ורקמות מעי .
    5. בסופו של פרוטוקול EFS לאמת את הסלקטיביות של EFS על ידי חסימת הולכה עצבית עם חוסם Na + הערוץ, tetrodotoxin (TTX; 0.5-1 &# 181; M). אם התכווצויות עמידות TTX עדיין קיימות, מומלץ להתאים את המשך ועוצמת הגירוי בניסויים הבאים.
  4. לקביעת ההשפעות של תרופות באתרים לפני או אחרי סינפטי (איור 7 א) בצע את שלבי 1 עד 4.3.2. להקים תגובות לשחזור לcarbachol וEFS, ולאחר מכן להוסיף X. תרופה
  5. בסופו של הניסוי, שחרר או להתיר את הרצועות, למחוק אותם בעדינות על פיסת נייר טישו כדי למנוע נוזלים עודפים ולמדוד המשקל של כל רצועה באמצעות איזון. גם למדוד את אורך הרקמות באמצעות קליפר כדי לקבוע אזור חתך. מידע זה משמש לנורמליזציה של נתונים (ראה סעיף 5.4).

ניתוח .5 נתונים

לנתח נתונים באמצעות תוכנה מתאימה (למשל, Windaq, LabChart).

  1. לפעילות ספונטנית, לבחור חלון של לפחות 30 שניות לפני ובשיא של תגובת התרופה המושרית ומשרעת ASURE ותדירות של פעילות myogenic (איור 3).
    1. השתמש בניתוח שינוי פורייה מהיר כדי לקבוע את הספקטרום של תדרים תורמים להתכווצות תגובות ואם יש הבדלים בין חלקים השונים של שלפוחית ​​השתן (לדוגמא, כיפה לעומת צוואר) או עם פיתוח, פתולוגיה, ותרופות 8.
  2. להשפעות על טונוס שרירים חלק לבחור חלון של לפחות 10-30 שניות לפני ובשיא של תגובת התרופה המושרית ולמדוד המשרעת של התכווצות.
  3. להשפעות על התכווצויות עצביות עוררות למדוד משרעת, משך ושטח מתחת לעקומה של התכווצויות (לפחות 3) לפני ובשיא של תגובת תוצאת משימוש בסמים.
    הערה: יש צורך למדוד גם את המשרעת ושטח מתחת לעקומה של התכווצויות נגרמות על ידי EFS בגלל שיש לי רכיבים purinergic והכולינרגית קינטיקה שונה. מרכיב purinergic הוא מהיר וחולף (ATP מפעיל purinergiערוצי ionotropic ג כגון P2X1 המאפשרים זרימה מהירה של סידן, אז הם להפחית רגישות), ובכך לתרום יותר לתגובת המשרעת שיא ופחות לשטח מתחת לעקומה. המרכיב הכולינרגית הוא איטי יותר ומתמשך (ACH מפעיל קולטנים מוסקריניים metabotropic, שדורשים זמן רב יותר כדי להפעיל מסלולים תאיים שסופו של דבר להפעיל את תעלות יונים שdepolarize שריר החלק לגרום להתכווצות). לפיכך, מרכיב מוסקריניים הוא נתפס טוב יותר על ידי מדידת השטח מתחת לעקומה.
  4. לנרמל את הנתונים כדי להיות מסוגל להשוות את התוצאות על פני רצועות וטיפולים תרופתיים. הפרמטר שנבחר לנורמליזציה לא צריך להיות מושפע מתרכובות הבדיקה, מצב פתולוגי למד או עיצוב ניסיוני. בין הפרמטרים האלה, במשקל רצועת שימוש, אזור חתך, תגובות KCl (איור 4),% מהתגובה המקסימלי (איור 7) או% מהתגובה המקסימלי לסוכן התכווצות נוספת(לדוגמא, CCH) או סוכנים מרגיעים (למשל, papaverine).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פעילות myogenic ספונטנית

פעילות myogenic ספונטנית היא אופייני שריר חלק חשוב שעובר שינויים עם התפתחות לאחר הלידה 6-9 ופתולוגיה (למשל, SCI, BOO) 3-5. משום שהאמינה כי פעילות זו תורמת לסימפטומים של פעילות יתר של שלפוחית ​​(OAB) 2, הערכה של קולטנים, מסלולים תאיים וסוכנים תרופתיים המווסתות אותו, היא בריבית גבוהה לפיתוח טיפולים יעילים לOAB וחוסר תפקוד שריר חלק אחר. השיטה המוצגת כאן יכולה בקלות לחקור את השאלות האלה איור 2 ממחיש דפוסי פעילות ספונטנית myogenic שונים במהלך ההתפתחות בילוד (i), נוער (ii) למבוגרים (iii) וחולדות בחוט השדרה נפגע. (SCI; iv). רצועות מחולדות בילוד להציג משרעת גדולה, התכווצויות בתדירות נמוכה קצביות (איור 2Ai), ואילו רצועות מחולדה בוגרתשל תערוכת משרעת קטנה, פעילות בתדירות גבוהה (איור 2Aii iii,). לאחר SCI דפוס הילוד מחדש עולה (איור 2Aiv). בנוסף לשימוש ברצועות ממודלים של בעלי חיים, ניתן להשתמש בסוכנים תרופתיים שונים לגרום להתכווצויות ספונטניות ברצועות מבעלי חיים תמימים, במטרה להבין את המנגנונים העומדים בבסיס ההתכווצויות הספונטניות. דוגמאות לסוכנים תרופתיים מתאימים כוללים אגוניסטים מוסקריניים קולט (carbachol; CCH)., תרכובות המגבירות את רמות ACH (כגון מעכבי esterase אצטילכולין), ריכוזים נמוכים של KCl (למשל, 20 מ"מ) או תרופות ניסיוניות אחרות דמויות 3A-B, להמחיש אפנון פעילות הספונטנית של סוכנים תרופתיים הפועלים על ערוצי KCNQ ממוקמים על שריר החלק. פותחן ערוץ KCNQ, flupirtine, מקטין את המשרעת ותדירות של פעילות ספונטנית באופן תלוי ריכוז (איור 3Ai-iii), ואילוחוסם ערוץ KCNQ, XE991, מקטין את המשרעת אך מגדיל את התדירות של פעילות ספונטנית (איור 3Bi-iii).

טונוס שרירים חלק

מאפייני טונוס שרירים חלקים והתכווצות הם גורמים חשובים לתפקוד תקין של שלפוחית ​​השתן במהלך אחסון ורקה. שיטה זו יכולה בקלות לסנן את ההשפעות של סוכנים תרופתיים על טונוס שרירים חלק. תרשימי 3Aiv ו3Biv מראים כי flupirtine יורד טון בסיסי, עולה בקנה אחד עם הרפיה של שריר חלק, ואילו טונוס שרירים החלק עליות XE991. איור 4 ממחישות עליות תלויות ריכוז בטונוס שרירים חלק על ידי הפעלת קולטנים bombesin עם neuromedin B (NMB; איור 4 א, ​​ב) או קולטני מוסקריניים עם carbachol (CCH; 4C דמויות, D). יתר על כן, ניתן לחקור מסלולים תאיים המתווכים תגובות שריר חלק אלה uלשיר מאפננים ספציפיים (מידע לא מוצג).

תגובות ואפנון של עצבי מתווך עצבי

התכווצות שלפוחית ​​השתן מושגת על ידי שחרורו של אח / ATP מהעצבים הפאראסימפתטית efferent. התרומה של מערכות מוסקריניים וpurinergic להתכווצות שלפוחית ​​השתן משתנה בין מינים ומצבים פתולוגיים, עם עלייה בולטת בתרומת purinergic בפתולוגיות כגון דלקת שלפוחית ​​השתן interstitial, חסימת מוצא חלקית, ופעילות יתר של שלפוחית ​​26. איור 5 ג מדגים את השימוש בשיטה זו כדי לקבוע את התרומה של רכיבי מוסקריניים וpurinergic להעברה עצבית ברצועות שלפוחית ​​השתן מהעכבר. תרומתו של הרכיב הכולינרגית הוערכה באמצעות אנטגוניסט לרצפטור מוסקריניים, אטרופין. תרומתה של מערכת purinergic הוערכה באמצעות activator purinergic קולט וdesensitizer, אלפא, בטא מתילמז ATP (ABMA). בנוסף, התרומה תלויה בתדירות של כל רכיב הוערכה על ידי שינוי תדר הגירוי מנמוך לתדרים גבוהים (2-50 Hz).

הכוח של התכווצות שלפוחית ​​השתן משחק תפקיד משמעותי ברקה ביעילות. באמצעות שיטה זו, ניתן לחקור קולטנים ומסלולים המווסתים שידור עצבי כמטרה לתרופות לביטול חוסר תפקוד. קולטנים 5HT4 באים לידי ביטוי לפני junctionally בתאי עצב הפאראסימפתטית וההפעלה שלהם מגבירה את רמות ACH 27. איור 6 ממחיש את האפקט מעורר של אגוניסט 5HT4 קולט, cisapride, ברצועות בשלפוחית ​​השתן ומעי אדם.

יכולים להיות מועסקים פרוטוקולי ניסוי שונים כדי לקבוע את אתר פעולה של מתחם בדיקה. תרשים באיור 7 א ממחיש פרוטוקול המשמש כדי להעריך מראש לעומת אתרי פוסט junctional. אם X התרופה מפחית (או עליות) תגובת EFS ​​אבל אין effect בתגובת CCH, סביר להניח שהאתר של פעולה הוא מראש junctional. אם משתנה בX הסמים, היא בתגובת EFS ​​וCCH, אז זה יכול לפעול על רצפטורים הממוקמים לאחר junctionally או שניהם-junctionally לפני ואחרי.

תפקיד של כל רכיב: שריר חלק, רירית, ועצבית

מצבים פתולוגיים שונים עלולים להשפיע על רכיבים שונים של שלפוחית ​​השתן. לדוגמא דלקת שלפוחית ​​השתן interstitial (IC) משפיעה בעיקר urothelium, בעוד OAB עלול לגרום להתכווצות שריר חלק שונה. כמו כן, קולטני שונה עשויים לבוא לידי ביטוי בכל אחד ממרכיבים בשלפוחית ​​השתן ובכך יכול להיות ממוקד במיוחד בפתולוגיה מסוימת. בניגוד לשיטות in vivo, אשר מודדות השפעה נטו של כל הרכיבים בשלפוחית ​​השתן, בשיטה זו במבחנה מאפשרת החקירה של רכיבים מסוימים על ידי שימוש בשילוב של ניתוחים ותרופתיים. כדי לבדוק התכווצות / הרפיה של שריר חלק בהעדר עצבישידור, TTX (0.5-1 מיקרומטר) ניתן להוסיף לאמבטיה. באיור 4, NMB וCCH נבדקו בנוכחותו של TTX. כדי לבדוק את תרומתה של הרירית (urothelium וpropria lamina) להתכווצות שריר החלק, רצועות עם ובלי השכבה הרירית הן בהשוואה. איור 7 מראה כי תגובות לCCH מופחתות בנוכחות של הרירית בחזיר 28. תוצאות דומות דווחו ברצועות שלפוחית ​​השתן אנושיות 29. כדי לבדוק את התפקיד של סיבי עצב, שניתן לנקוט במספר גישות. אחת מהן הוא כדי להפעיל או לעכב סיבים ספציפיים באמצעות סוכנים תרופתיים. לדוגמא, קפסאיצין מפעיל אוכלוסייה ספציפית של עצבים מביא וגורם למינים התכווצות תלויה שריר חלק או הרפיה 17,18. Guanethidine מעכב את שחרורו של נוראפינפרין מסיבים אוהדים, ובכך לחסל את התרומה של סיבים אלה. גישה נוספת היא להוריד את רמת רגישות / לחסל סיבים ספציפיים in vivoלפני הניסוי. לדוגמא, טיפול מערכתי בבעלי החיים עם קפסאיצין desensitizes עצבים מביא רגישים קפסאיצין. רכיבי שלפוחית ​​השתן אחרים שניתן ללמוד בהכנה זו הם תאי ביניים או צמתים פער על ידי הפעלה או חסימה שלהם עם סוכנים ספציפיים.

הבדלי מינים

בעוד שרוב פיתוח תרופות מיועד לטיפול בהפרעות אנושיות, מחקר בסיסי מתבצע בעיקר ברקמה מן החי. הבדלי מינים קיימים במספר הקולטנים. לדוגמא, אגוניסטים לקולטן 5HT4 לשפר התכווצויות עצביות עוררות בשלפוחית ​​השתן האנושית, אבל לא בשלפוחית ​​העכברוש 19,30, הנגרם על ידי EFS התכווצויות הן כמעט אך ורק אטרופין רגיש בdetrusor קוף אדם ושל עולם ישן משלפוחיות יציבה 31 באבל הפכו באופן חלקי אטרופין עמיד בdetrusor אדם מחולים עם מצבי שלפוחית ​​בלתי יציבים (למשל, עצבי, obstructeשלפוחיות ד) 15,32,33, קפסאיצין מעורר תגובה מעוררת ברצועות חולדה ושלפוחית ​​שתן אנושית, אין תגובה ברצועות שלפוחית ​​חזיר ותגובה מעכבת ברצועות שלפוחית ​​השתן שפן ניסיונות 17,18. איור 4 מראה שbombesin אגוניסטים לקולטן יש השפעות מעוררות על שלפוחית ​​השתן של חולדה וללא תופעות על רצועות עכבר ושלפוחית ​​שתן חזיר 16. מידע זה הוא קריטי לבחירת מודל החיה המתאימה ללימוד קולטן מסוים.

השוואה של רגישות על פני איברים

תרופות מיועדות לטיפול בהפרעות בשלפוחית ​​השתן עשויות להשפיע גם על שריר חלק מאיברים אחרים, כגון מערכת העיכול, שופכה, כיס מרה, וכו 'שיטה זו מאפשרת הערכה של הסלקטיביות איבר ורגישות לסוכן תרופתי על ידי השוואת רקמות שונות זה לצד זה. כפי שמודגם באיור 6, אגוניסט קולטן 5HT4, cisapride, יש שונהיעילות אף אוזן גרון ועצמה בשלפוחית ​​שתן אנושית לעומת רקמת מעי.

איור 1
איור 1 הכנת הקמה ורצועת שלפוחית ​​השתן ניסויית.) סכמטי של הגדרת הניסוי. רצועות שלפוחית ​​השתן הם טבלו בתאי רקמה מלאים פתרון קרבס סודה המשיכו ב37 ° C באמצעות משאבת מים במחזור. קצה אחד של הרצועה מחובר למתמר כוח איזומטרי למדוד התכווצות רקמות, אחרות למוט קבוע. מתמר הכוח מחובר למגבר ומחשב להקלטת נתונים. אלקטרודות גירוי שדה חשמלי מחוברות לממריץ הממוקמות בתא ומשמשות ללעורר התכווצויות בשלפוחית ​​השתן מתווך עצבי. הכנת B) של רצועות רקמה. שלפוחית ​​השתן הוא מרותק בצלחת והנהלים הבאים מבוצעים: # 1 ה חתך אנכיתמחצית הגחון ough של שלפוחית ​​השתן משופכה לכיפה כדי לפתוח את שלפוחית ​​השתן לתוך גיליון שטוח. # 2 חתכים אופקיים הסרת הכיפה ובסיס שלפוחית ​​השתן / השופכה הפרוקסימלית. . # 3 חתכים אנכיים חלוקת אמצע שלפוחית ​​השתן לרצועות שווה (4 רצועות משלפוחית ​​שתן של חולדה) C) סכמטי של רכיבי פס: שריר ורירית חלק, שניהם מביא (כחולה המכיל) וefferent עצבים (ירוק). רירית מורכבת מpropria urothelium וlamina. propria lamina מכיל כלי דם [1], תאי ביניים [2], וmuscularis mucosae [3]. קו המקווקו שכותרתו # 2b מציין את ההליך להסרת שכבת רירית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2 פעילות ספונטנית myogenic במהלך פיתוח ואחריהפתולוגיה.) דוגמאות לפעילות ספונטנית בילוד (i), מבוגרים לנוער (ii), מבוגר השדרה שלם (iii) ואת חוט השדרה נפגע (SCI) (iv) רצועות שלפוחית ​​עכברוש. עכברוש SCI שימש ב 4 שבועות לאחר ניתוח. B, סיכום C) של משרעת (B) ותדירות (C) של התכווצויות ספונטניות בארבע הקבוצות נחקרות. (לשכפל באישור Artim DE, Kullmann FA, דוהרטי SL, Bupp E, אדוארדס CL, דה גריסים WC Neurourol Urodyn נו 2011; 30 (8):.. 1666-1674.) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.

איור 3
איור אפנון 3 של פעילות ספונטנית myogenic וטונוס שרירים חלק.) ההשפעה של פותחן ערוץ KCNQ, flupirtine, על פעילות ספונטנית וצליל בסיסי ברצועות שלפוחית ​​עכברוש מבוגרות. (I) Flupirtine נוספה בהגדלת ריכוזים (במצטבר) במועדים שצוינו על ידי חיצים. הגדלות מתחת לדקות עקבות מופע 4 פעילות הרצועה במהלך שליטה ולאחר היישום של 10 מיקרומטר ו50 flupirtine מיקרומטר. (Ii-iv) סיכום של השפעות של flupirtine (7 רצועות מ4 חולדות) על משרעת (ii) ותדירות (iii) של פעילות ספונטנית וצליל בסיסי (iv), הביע כשינוי% משליטת ערכים (טרום תרופה) , אשר נקבעו ל100%. B) ההשפעה של חוסם KCNQ הערוץ, XE991, על פעילות ספונטנית ואת טון בסיס ברצועות שלפוחית ​​עכברוש מבוגרות. (I) XE991 נוספה בהגדלת ריכוזים (במצטבר) במועדים שצוינו על ידי חיצים. הגדלות מתחת לעקבות להראות 2 דקות של פעילות ברצועה בשליטה ואחרי היישום של 10 מיקרומטר ו50 XE991 מיקרומטר. (Ii-iv) סיכום של השפעות של XE991 (9 רצועות מ4 חולדות) עלמשרעת (ii) ותדירות (iii) של פעילות ספונטנית וצליל בסיסי (iv), הביע כשינוי% משליטת ערכים (טרום תרופה), שנקבעו ל100%. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .

איור 4
הבדלי איור 4 מינים. התכווצויות שרירים ריכוז) תלויות חלקות בתגובה לאגוניסט קולטן bombesin, neuromedin B (NMB), ברצועות בשלפוחית ​​השתן של חולדה. B) סיכום של השפעות של NMB על התכווצות שריר חלק ברצועות שלפוחית ​​עכברוש. נתונים מנורמלים לKCl (80 מ"מ) תגובה. C, D) היעדרות של תגובות לNMB בעכבר (C) ורצועות שלפוחית ​​חזיר (ד '). Carbachol (CCH) מעורר con התלוי ריכוז חזקtractions בשתי רצועות העכבר וחזיר, מצביע על כך שהרצועות יכולות להגיב לגירויים. TTX (0.5 מיקרומטר) היה נוכח באמבטיה בכל הרצועות. (לשכפל באישור Kullmann FA, מקנה D, ולס GI, Thor KB נוירופפטידים 2,013 אוקטובר; 47 (5):.. 305-13) אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5 גירוי שדה חשמלי.) סכמטי של פרמטרים גירוי דופק יחידים. קיצורים: D = משך הדופק, i = עוצמת הדופק, IPI = היתר דופק מרווח B) סכמטי של פרמטרים גירוי רכבת.. קיצורים: משך td = רכבת, i = עוצמת הדופק, ITI = מרווח רכבת היתר. הבלעה מראה את מספר הפעימות ברכבת והמרווח betwEen, אשר יחד עם משך רכבת לקבוע את התדירות של גירוי רכבת. C)   תרומה של רכיבי purinegic והכולינרגית לעוררת עצבית התכווצויות בשלפוחית ​​השתן. EFS-FR לייצג תדרי גירוי, 2, 5, 10, 20, 50Hz. שלושה גירויים מועברים כל שניה 90 נבדקו עבור כל תדר וכל סדרת תדירות חזרה על עצמו פעמיים בשליטה ופעמים לאחר הוספת כל מתחם. אלפא, ATP beta-תילן, מקוצר ABMA (רצועה 1), היה בשימוש להוריד את רמת רגישות הקולטנים ואטרופין (רצועה 2) שימש כדי לחסום קולטני מוסקריניים purinergic. רצועת 3 שימשה כבקרה וטופלה ברכב, המים. חצים מצביעים על תקופה שבה כל מתחם נוסף לכל רצועה. שים לב שהתכווצויות עוררו EFS מופחתות מאוד על ידי ABMA ואטרופין, ואילו אינם מושפעת מהרכב. TTX נוספו בסוף הניסוי תוך EFS נמסר ב20 הרץ. שימו לב שהתכווצויות שנותרו נצפו בשליטהרצועת 3 בוטלו על ידי TTX, מפגינה אופיים העצבי (כלומר ביוזמת שחרור משדר מעצבי ביצוע העצמיים). # מציין תגובות שריר חלק לABMA בהעדר EFS. ברים סולם הם 5 דקות לציר x ו -2 גרם לציר y. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6 אפנון של התכווצויות בשלפוחית ​​השתן עצבית עוררות., B) דוגמאות לשיפור של ההתכווצויות העצביות העוררות על ידי אגוניסט קולטן 5HT4, cisapride בשלפוחית ​​שתן אנושי () ורצועות מעי (B). Cisapride (רשומות השחור) או DMSO (רשומות האפור) נוספה באופן תלוי ריכוז במועדים שצוינו על ידי חיצים. פסים שחורים מתחת לשיאים בכל לוחמייצג EFS, שהיה מורכב מ10 רכבות שניות נשאו ב20 הרץ כל שניה 120. ברים בקנה מידה אנכיים הם 1 גרם לכולם דוגמאות. ריכוז TTX היה 0.5 מיקרומטר סיכום. CF) של השטח מתחת לעקומה (AUC) של התכווצויות עוררו EFS בתגובה לcisapride (פסים שחורים) או DMSO (פסים אפורים) ברצועות שלפוחית ​​השתן (C, D) ורצועות מעי (E , F). בCF, SB עומד על SB-203,186, המייצג סיכום של נתונים המתקבלים לאחר התוספת של אנטגוניסט לרצפטור 5HT4. קווים מקווקווים מוגדרים 100% ולייצג את השליטה. (לשכפל באישור Kullmann FA, Kurihara R, יה L, ולס GI, מקנה DG, Burgard EC, Thor KB Auton Neurosci 2,013 ג'ון: 176 (1-2):... 70-7) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
Fiתרשים 7 אתרי פעולה של תרופות ותפקידם של רכיבים שונים של שלפוחית ​​השתן.) סכמטי של פרוטוקול לזיהוי אתר פעולה של תרופה. רצועות מגורה עם ESF וcarbachol (CCH). בi X התרופה מפחיתה את תגובת EFS ​​אבל לא תגובת CCH, המצביע על אתר מראש junctional פעולה. בii, X התרופה משנה את שני התגובות, המצביע על פעולה על קולטנים פוסט junctional או שניהם לפני ואחרי junctional. B השפעה) של רירית על התכווצות שריר חלק. השפעות של carbachol הם פחתו ברצועות עם הווה הרירית (בשלמות) בהשוואה לרצועות עם הרירית הוסרה (הערומה). (B הוא לשחזר באישור עוזרר MH, Chapple CR, זין M, השחמט-וויליאמס ר 'Br J Pharmacol 2,000 פבואר; 129 (3):. 416-9). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במאמר זה אנו מתארים פשוטים בשיטת מבחנה שריר חלק התכווצות שיכול לשמש כדי לטפל במספר השאלות מדעיות חשובות הקשורים לפיזיולוגיה בשלפוחית ​​השתן ופתולוגיה, כמו גם סיוע לגילוי תרופות חדשות לטיפול בתפקוד שלפוחית ​​השתן. יש לנו הדגמתי את השימוש בשיטה זו להערכת מאפיינים התפתחותיים, פתולוגי ותרופתיים של התכווצות שריר חלק בשלפוחית ​​השתן (איורים 2-4), אפנון עצבית (5-7A איורים), מיני הבדלים (איור 4), הבדלי איבר (איור 6) ואת הרלוונטיות של רכיבי שלפוחית ​​השתן ספציפיים (למשל, רירית, איור 7). יישומים נוספים שאינו מוצגים כאן כוללים הערכה של מסלולים תאיים באמצעות סוכנים תרופתיים 3,10,11, יחסי מבנה פעילות של תרופות שונות 22-24, או הערכה / כימות rele משדרASE לאחר גירוי עצבי 25.

בעוד תפקוד שלפוחית ​​השתן עשוי סופו של דבר להיות מוערך in vivo, בשיטה זו במבחנה מתגברת על מצבים רבים שהם בעייתיים in vivo. אלה כוללים מצבים שבם מניפולציות כירורגית ותרופתיות יפחיתו את הכדאיות ו / או הישרדות של האיבר או של בעלי החיים, השימוש ברקמה אנושית, בצורך לזהות ולאפיין את תגובות מרכיבים ספציפיים (לדוגמא, שריר חלק לעומת האפיתל לעומת עצבים ) או השימוש בכימיקלים יקרים. השיטה מאפשרת חקירה שיטתית של ההשפעות של סוכנים תרופתיים שונים, כמו גם פתולוגיה בפעילות התכווצות של שריר החלק ובאופנה וסביבה מבוקרים היטב.

השיטה מספקת שפע של מידע; עם זאת, יש לנקוט בזהירות בעת הפירוש וחיוץ מידע זה. זוהי שיטה במבחנה של הכנה מופחתת, דיסמחובר מהסביבה הרגילה שלו ושליטה עצבית. תנאי הניסוי הם לא פיסיולוגיים, ובכך ייתכן שהנתונים לא לגמרי משקפים במצבים פיסיולוגיים vivo. לדוגמא, השיטה לא יכולה להסביר את שינויים בזרימת דם, הורמונים, חומרי לחות, כוחות מכאניים חיצוניים, או שליטה עצבית חיצונית. רקמה מבוזר בחריפות, ובכך תגובות פציעה ואיסכמיה הקשורים צריכה להיות מוערכות ונלקחו בחשבון. שינויים פתולוגיים המתרחשים בחוט המוח או בעמוד השדרה אי אפשר לבחון את השימוש בשיטה זו, אלא אם כן הם כבר שינו מביא, שריר חלק, רירית או פונקצית ביצוע עצמית עצב (כלומר פלסטיות סלולרית). גירוי חשמלי שדה (EFS) מאפשר ההערכה של תגובות בתיווך העצבית. עם זאת, זה מרגש את הבחנה את כל העצבים ברצועה (למשל, סימפטית, הפאראסימפתטית, afferents), בניגוד למצב in vivo שבו רפלקס השתנה מפעיל pathw מסוים בלבדays. דרך אחת להתגבר על מצב זה היא לשלב EFS עם יריבים ספציפיים שאופן סלקטיבי לחסום מסלולים שונים. לדוגמא, guanethidine יכול לשמש כדי לחסום שחרור נוראפינפרין כאשר לומד תכונות כיווץ, או אטרופין יכול לשמש כדי לחסום קולטני מוסקריניים כדי למנוע התכווצויות בשלפוחית ​​השתן כאשר לומדים את מאפייני הרפיה. לבסוף, יכולת קיום של הרקמה מוגבלת למספר מסוים של שעות. באופן כללי, רוב הרכיבים של רקמת שלפוחית ​​השתן הם קיימא ויציבים (כלומר להגיב לEFS ללא תגובות מתדרדרים) על פני תקופה של 6-8h או יותר. עם זאת, רקמות אחרות עשויות להיות רגישות יותר (לדוגמא, מעי עקום נמשכת ~ 6 שעות או פחות; הניסיון האישי של המחבר).

למרות שהשיטה היא אפשרית מבחינה טכנית ועם שחזור טוב, יש כמה שלבים קריטיים דרושים כדי להבטיח את הצלחתה. ראשית, הכנת רקמה יש לבצעו בזהירות כדי להבטיח את יכולת קיום על ידי ביצוע שינויים הנדרשיםלהליך לנתיחה (להימנע ממתיחת הרקמה בעת הכנת הרצועות) ו / או תקשורת במידת הצורך לסוגי רקמות שונות או מינים. עוד צעד קריטי הוא הגדרה למעלה פרמטרים גירוי עצביים, כך שהשפעות תקרה נמנעות. כפי שתואר בסעיף השיטה, זה תלוי בסוג של מנגנון הניסוי שבוצע וצפוי של פעולה של מתחם הבדיקה. לדוגמא, לבדיקת השפעות של cisapride, אגוניסט קולטן 5HT4, על רצועות שלפוחית ​​השתן (איור 6), שהצבנו את המשרעת של התכווצות עוררו EFS ל~ 50% ממקסימאליים. זה היה מבוסס על המנגנון הידוע של פעולה של אגוניסטים לקולטן 5HT4, כלומר שיפור שחרור ACH מהעצבים הפאראסימפתטית מראש junctional 27, אשר בתורו צפוי להגדיל את ההתכווצויות עוררו EFS. גירוי של שריר לעומת עצבים צריך להיבדק באמצעות TTX, אשר מעכב העברת עצבית ובכך צריך לעכב התכווצויות עוררו EFS. בקרות נאותות לכלי רכב וtimדואר חייבת להתבצע במהלך בדיקות סמים לדין וחשבון על ההידרדרות של הרקמות עם עת ומכל השפעות אפשריות של הרכב. לדוגמא, תרופות רבות מומסים DMSO או אתנול. הנתונים שלנו (איור 6) מראים כי DMSO (0.1% ויותר) יכול להגדיל את ההתכווצויות עצביות עוררות, השפעה אשר צריכה להיות מופחתים ההשפעה של תרופת המבחן. באופן דומה, אתנול (עד 1%) מפחית את התכווצויות שריר חלק הספונטניות אך אין כל השפעה על התכווצויות עוררות עצביות 34,35. אם שימוש בבעלי חיים מהונדסים גנטי או מודלים כירורגית (לדוגמא, פגיעה בחוט השדרה או ovariectomy), צריכה בקרות כוללות רקמה מהזן המתאים עכבר רקע או בעלי החיים מזויפים פעל, בהתאמה. בנוסף, חלק מרקמות, כגון שלפוחיות אדם, עכבר ושפן ניסיונות להכיל גרעיני ביצוע עצמיים. כאשר עובדים עם רקמות אלה, חייבות בחירת פרוטוקול ופרשנות נתונים לקחת בחשבון השפעות של תרופות או EFS על ne ביצוע עצמיurons שנוסף לעורר את שריר החלק.

עיצוב פרוטוקול הניסוי, בחירת הפרמטרים הנכונים (לEFS, לגירוי בסמים) וריכוזים שנבדקו הם קריטי כדי להבטיח נתונים משמעותיים. בעוד פרמטרים צריכים להיות מותאמים לרקמות אדם וסמים, עקרונות כלליים / הנחיות המפורטות להלן חלות. עקומות תגובת ריכוז מצטברות רצויות, עם זאת זה לא אפשרי עבור כל התרכובות. תרופות המכוונות לקולטנים הלהפחית רגישות, כגון קולטנים purineric ionotropic (P2X), או תרופות שעוברים מטבוליזם במהירות ברקמות (לדוגמה ACH), לא ניתן לבדוק באופן מהימן באמצעות עקומות תגובת ריכוז המצטברות באותה הרקמה. במקרים אלה, ריכוזים בודדים נבדקים בקבוצות שונות של רקמות. כדי להעריך את הפחתת רגישות, מומלץ להשוות את עוצמת תגובה שהושרו על ידי ריכוז הגבוה ביותר יחיד לזה שהושג בסופו של ריכוז מצטברעקומת תגובה.

עבור הולם מדויקת של נתונים המתקבלים מעקומות תגובת ריכוז, רצוי לבדוק את מחצית ריכוזי יומן (דוגמא CCH באיור 6). עם זאת, ריכוזי יומן (דוגמא NMB באיור 4 א) הם מקובלים כאשר כדאיות רקמות עשויה להיות מוגבלות או אילוצים אחרים עשויים להיות במקום.

כדי לבחור טווח ריכוז למתחם רומן, בניסויים ראשוניים, כדאי לשקול את הזיקה המחייבת של המתחם ובדיקת שני כוח של 10 מעל ומתחת הריכוז ש. בניסויים הבאים, הפרוטוקול הוא מעודן כדי לקבוע נקודת התחלה שבו אין השפעה של התרופה הוא ציינה ונקודת סיום שבו גם התגובה היא מקסימלי או הריכוז נבדק הוא כבר לא ספציפי למטרה המיועדת.

מרווח הזמן ליישום תרופה צריך להיבחר תוך כמה גורמים בחשבון: א) זמן לתרופה יש השפעה. בתרופות כלליות מיקוד קולטני קרום יש תגובה מהירה יחסית (שניות עד דקות), ואילו תרופות למטרות תאיות (למשל, forskolin ומעכבי אנזים אחרים 36, רעלן הבוטולינום 37) דורש זמן נוסף דגירה (30 דק '- 3 שעות). בנוסף, עובי רקמה עשוי לשחק תפקיד. ב) משך ומנגנון פעולה של תרופה. למקרים שבם השפעת התרופה מגיעה לרמה שהוא ספג, כגון NMB באיור 4 א וcisapride באיור 6, במרווחים של 5-15 דקות בין יישומי תרופת זמן מספיקים לאיסוף נתונים מספקים. זה לא אפשרי עם תרופות שיש משך קצר בהרבה של פעולה או מנגנון פעולה שונה (ATP, CCH). לדוגמא ההשפעה של CCH באיור 4C או 4D, מגיעה לרמה במהירות, אבל מתח הרקמות נוטה לחזור לנקודת התחלה. במקרה זה, במרווחי הזמן צריכים להיות מותאמים על פיly, בדרך כלל הוספת הריכוז הבא כאשר התגובה הראשונה מגיעה לכל היותר.

ניתוח נתונים, נורמליזציה במיוחד של נתונים על מנת לאפשר השוואה בין הרצועות הוא צעד חשוב מאוד. מחקרים שונים משתמשים בפרמטרים שונים לנורמליזציה, כוללים משקל רצועה 38, אזור חתך רוחב פס 39, תגובת KCl 12,% מתגובה מקסימלי 28 או% מהתגובה המקסימלי לסוכן התכווצות אחר (לדוגמא, CCH 38). יש לבחור פרמטר הנורמליזציה בהתאם למטרתו של הניסוי, כך שהפרמטר אינו מושפע מתרכובות בדיקה, פתולוגיה או עיצוב ניסיוני. לדוגמא, נורמליזציה לתגובת KCl מבטלת את המשקל וממדים אחרים של הרצועות, ובכך יכולה לשמש כדי להשוות את תגובות ברקמות שבו מצב פתולוגי עשוי להגדיל את המשקל של הרצועות (לדוגמא, סוכרת מגדילה את המסה בשלפוחית ​​השתן). בנוסף, מחדשsponse לKCl אינו מושפע על ידי הסרה של הרירית / urothelium 29, ובכך יוכל לשמש בניסויי הערכת מרכיבים שונים של שלפוחית ​​השתן (לדוגמא, רירית לעומת שרירי חלקים).

לסיכום, שיטת התכווצות זו מספקת גישה מהירה, קלה וחזקה מאוד להעריך שלפוחית ​​השתן (ואיברים אחרים) פיזיולוגיה ופרמקולוגיה. כאשר משתמש בו כראוי, הוא מספק את היכולת לתפעל רקמות בסביבה מופחתת ומבוקרת היטב. במחקר של תפקוד שלפוחית ​​השתן בדרכי השתן, בשיטה זו סייעה בגילוי והבדיקה של תרכובות המשמשות כיום לניהול OAB, כגון antimuscarinics וחדש שפותח β 3 AR אגוניסטים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מענקי NIH R37 DK54824 וR01 DK57284 לק"ג

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Tissue Bath System with Reservoir Radnoti, LLC 159920 isolated tissue baths
Warm water recirculator pump Kent Scientific Corporation  TPZ-749 to keep tissue baths to 37 °C
Computer
Data Acquisiton System DataQ Instruments DI-710-UH To view, record and analyze data
Transbridge Transducer Amplifier World Precision Instruments SYS-TBM4M Transducer amplifier
Grass stimulator Grass Technologies Model S88 Stimulator
Anesthesia System Kent Scientific Corporation  ACV-1205S To anesthetesize the animal
Anesthetizing Box Harvard Apparatus 500116 To anesthetesize the animal
Anesthesia Masks Kent Scientific Corporation  AC-09508 To anesthetesize the animal
Materials and Surgical Instruments
Sylgard Dow Corning Corp 184 SIL ELAST KIT To pin, dissect, & cut tissue
Petri Dish Corning 3160-152 To dissect/cut tissue
Insect Pins ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins Size 5 To pin tissue
Bench Pad VWR International 56617-014 Absorbent bench underpads
Rat surgical Kit Kent Scientific Corporation  INSRATKIT To remove and dissect tissue
2 Dumont #3 Forceps Kent Scientific Corporation  INS500064 To remove and dissect tissue
Tissue Forceps Kent Scientific Corporation  INS500092 To remove and dissect tissue
Scalpel Kent Scientific Corporation  INS500236 To remove and dissect tissue
Scalpel blade Kent Scientific Corporation  INS500239 To remove and dissect tissue
Professional Clipper  Braintree Scientific, Inc. CLP-223 45 To remove fur
Suture Thread Fine Science Tools 18020-50 Tie tissue
Tissue Clips Radnoti, LLC 158802 Attach tissue to rod/transducer
1 g weight  Mettler Toledo 11119525 For transducer calibration
Chemicals
Krebs Solution:
Sodium chloride
Potassium chloride
Monobasic potassium phosphate
Magnesium sulfate
Dextrose
Sodium bicarbonate
Calcium chloride
Magnesium chloride		  
Sigma
Fisher
Fisher
Fisher
Fisher
Sigma
EMD
Baker		  
S7653
P217-500
P285-3
M65-500
D16-500
S5761
CX0130-2
2444		 To prepare Krebs solution
Isoflurane Henry Schein 029405 To anesthetesize the animal
 Oxygen tank Matheson Tri Gas ox251 To use with anesthesia system
Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide)  Matheson Tri Gas Moxn00hn36D To aerate Krebs solutions

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nat Rev Neurosci. 9, 453-466 (2008).
  2. Andersson, K. E. Detrusor myocyte activity and afferent signaling. Neurourol Urodyn. 29, 97-106 (2010).
  3. Artim, D. E., et al. Developmental and spinal cord injury-induced changes in nitric oxide-mediated inhibition in rat urinary bladder. Neurourology and urodynamics. 30, 1666-1674 (2011).
  4. Kita, M., et al. Effects of bladder outlet obstruction on properties of Ca2+-activated K+ channels in rat bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 298, 1310-1319 (2010).
  5. Barendrecht, M. M., et al. The effect of bladder outlet obstruction on alpha1- and beta-adrenoceptor expression and function. Neurourol Urodyn. 28, 349-355 (2009).
  6. Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A. Postnatal development of myogenic contractile activity and excitatory innervation of rat urinary bladder. The American journal of physiology. 247, 972-978 (1984).
  7. Ng, Y. K., de Groat, W. C., Wu, H. Y. Smooth muscle and neural mechanisms contributing to the downregulation of neonatal rat spontaneous bladder contractions during postnatal development. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 292, 2100-2112 (2007).
  8. Szell, E. A., Somogyi, G. T., de Groat, W. C., Szigeti, G. P. Developmental changes in spontaneous smooth muscle activity in the neonatal rat urinary bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 285, 809-816 (2003).
  9. Szigeti, G. P., Somogyi, G. T., Csernoch, L., Szell, E. A. Age-dependence of the spontaneous activity of the rat urinary bladder. J Muscle Res Cell Motil. 26, 23-29 (2005).
  10. Frazier, E. P., Braverman, A. S., Peters, S. L., Michel, M. C., Ruggieri, M. R. Does phospholipase C mediate muscarinic receptor-induced rat urinary bladder contraction. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 322, 998-1002 (2007).
  11. Xin, W., Soder, R. P., Cheng, Q., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Selective inhibition of phosphodiesterase 1 relaxes urinary bladder smooth muscle: role for ryanodine receptor-mediated BK channel activation. American journal of physiology. Cell physiology. 303, 1079-1089 (2012).
  12. Frazier, E. P., Peters, S. L., Braverman, A. S., Ruggieri, M. R., Michel, M. C. Signal transduction underlying the control of urinary bladder smooth muscle tone by muscarinic receptors and beta-adrenoceptors. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 377, 449-462 (2008).
  13. Svalo, J., et al. The novel beta3-adrenoceptor agonist mirabegron reduces carbachol-induced contractile activity in detrusor tissue from patients with bladder outflow obstruction with or without detrusor overactivity. European journal of pharmacology. 699, 101-105 (2013).
  14. Yokota, T., Yamaguchi, O. Changes in cholinergic and purinergic neurotransmission in pathologic bladder of chronic spinal rabbit. J Urol. 156, 1862-1866 (1996).
  15. Bayliss, M., Wu, C., Newgreen, D., Mundy, A. R., Fry, C. H. A quantitative study of atropine-resistant contractile responses in human detrusor smooth muscle, from stable, unstable and obstructed bladders. J Urol. 162, 1833-1839 (1999).
  16. Kullmann, F. A., McKenna, D., Wells, G. I., Thor, K. B. Functional bombesin receptors in urinary tract of rats and human but not of pigs and mice, an in vitro study. Neuropeptides. 47, 305-313 (2013).
  17. Sadananda, P., Kao, F. C., Liu, L., Mansfield, K. J., Burcher, E. Acid and stretch, but not capsaicin, are effective stimuli for ATP release in the porcine bladder mucosa: Are ASIC and TRPV1 receptors involved. European journal of pharmacology. 683, 252-259 (2012).
  18. Maggi, C. A., et al. Species-related variations in the effects of capsaicin on urinary bladder functions: relation to bladder content of substance P-like immunoreactivity. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 336, 546-555 (1987).
  19. Kullmann, F. A., et al. Effects of the 5-HT4 receptor agonist, cisapride, on neuronally evoked responses in human bladder, urethra, and ileum. Autonomic neuroscience : basic & clinical. 176, 70-77 (2013).
  20. Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Human tachykinin NK2 receptor: a comparative study of the colon and urinary bladder. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30, 632-639 (2003).
  21. Zoubek, J., Somogyi, G. T., De Groat, W. C. A comparison of inhibitory effects of neuropeptide Y on rat urinary bladder, urethra, and vas deferens. The American journal of physiology. 265, 537-543 (1993).
  22. Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationship of neurokinin A(4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the effect of amino acid substitutions on receptor affinity and function. Biochem Pharmacol. 63, 2181-2186 (2002).
  23. Warner, F. J., Mack, P., Comis, A., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationships of neurokinin A (4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the role of natural residues and their chirality. Biochem Pharmacol. 61, 55-60 (2001).
  24. Dion, S., et al. Structure-activity study of neurokinins: antagonists for the neurokinin-2 receptor. Pharmacology. 41, 184-194 (1990).
  25. Somogyi, G. T., Zernova, G. V., Yoshiyama, M., Yamamoto, T., de Groat, W. C. Frequency dependence of muscarinic facilitation of transmitter release in urinary bladder strips from neurally intact or chronic spinal cord transected rats. British journal of pharmacology. 125, 241-246 (1998).
  26. Andersson, K. E., Wein, A. J. Pharmacology of the lower urinary tract: basis for current and future treatments of urinary incontinence. Pharmacological reviews. 56, 581-631 (2004).
  27. D’Agostino, G., Condino, A. M., Gallinari, P., Franceschetti, G. P., Tonini, M. Characterization of prejunctional serotonin receptors modulating [3H]acetylcholine release in the human detrusor. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 316, 129-135 (2006).
  28. Hawthorn, M. H., Chapple, C. R., Cock, M., Chess-Williams, R. Urothelium-derived inhibitory factor(s) influences on detrusor muscle contractility in vitro. British journal of pharmacology. 129, 416-419 (2000).
  29. Chaiyaprasithi, B., Mang, C. F., Kilbinger, H., Hohenfellner, M. Inhibition of human detrusor contraction by a urothelium derived factor. J Urol. 170, 1897-1900 (2003).
  30. Testa, R., et al. Effect of different 5-hydroxytryptamine receptor subtype antagonists on the micturition reflex in rats. BJU international. 87, 256-264 (2001).
  31. Craggs, M. D., Rushton, D. N., Stephenson, J. D. A putative non-cholinergic mechanism in urinary bladders of New but not Old World primates. J Urol. 136, 1348-1350 (1986).
  32. Fry, C. H., Bayliss, M., Young, J. S., Hussain, M. Influence of age and bladder dysfunction on the contractile properties of isolated human detrusor smooth muscle. BJU international. 108, 91-96 (2011).
  33. Kennedy, C., Tasker, P. N., Gallacher, G., Westfall, T. D. Identification of atropine- and P2X1 receptor antagonist-resistant, neurogenic contractions of the urinary bladder. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 845-851 (2007).
  34. Levin, R. M., Danek, M., Whitbeck, C., Haugaard, N. Effect of ethanol on the response of the rat urinary bladder to in vitro ischemia: protective effect of alpha-lipoic acid. Molecular and cellular biochemistry. 271, 133-138 (2005).
  35. Malysz, J., Afeli, S. A., Provence, A., Petkov, G. V. Ethanol-mediated relaxation of guinea pig urinary bladder smooth muscle: Involvement of BK and L-type Ca2+ channels. American journal of physiology. Cell physiology. 306, 45-58 (2013).
  36. Longhurst, P. A., Briscoe, J. A., Rosenberg, D. J., Leggett, R. E. The role of cyclic nucleotides in guinea-pig bladder contractility. British journal of pharmacology. 121, 1665-1672 (1997).
  37. Takahashi, R., Yunoki, T., Naito, S., Yoshimura, N. Differential effects of botulinum neurotoxin A on bladder contractile responses to activation of efferent nerves, smooth muscles and afferent nerves in rats. J Urol. 188, 1993-1999 (2012).
  38. Sadananda, P., Chess-Williams, R., Burcher, E. Contractile properties of the pig bladder mucosa in response to neurokinin A: a role for myofibroblasts. British journal of pharmacology. 153, 1465-1473 (2008).
  39. Liu, G., Daneshgari, F. Alterations in neurogenically mediated contractile responses of urinary bladder in rats with diabetes. American journal of physiology. Renal physiology. 288, 1220-1226 (2005).

Tags

רפואה גיליון 90 קרבס הבדלי מינים, התכווצות שריר חלק גירוי עצבי
שריר חלק בשלפוחית ​​השתן רצועת התכווצות כשיטה להערכת נמוכה יותר בדרכי שתן פרמקולוגיה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kullmann, F. A., Daugherty, S. L.,… More

Kullmann, F. A., Daugherty, S. L., de Groat, W. C., Birder, L. A. Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology. J. Vis. Exp. (90), e51807, doi:10.3791/51807 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter