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Vejiga contractilidad del músculo liso de Gaza como un método para evaluar tracto urinario inferior Farmacología

Published: August 18, 2014 doi: 10.3791/51807
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,2
1Department of Medicine, Renal division, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Este manuscrito presenta una simple, pero potente, método in vitro para evaluar la contractilidad del músculo liso en respuesta a agentes farmacológicos o la estimulación nerviosa. Las principales aplicaciones son la detección de drogas y la comprensión fisiología del tejido, la farmacología y la patología.

Abstract

Se describe un método in vitro para medir la contractilidad del músculo liso de la vejiga, y su uso para la investigación de las propiedades fisiológicas y farmacológicas de músculo liso, así como los cambios inducidos por la patología. Este método proporciona información crítica para la comprensión de la función de la vejiga, mientras que la superación de las principales dificultades metodológicas encontradas en los experimentos in vivo, tales como manipulaciones quirúrgicas y farmacológicas que afectan la estabilidad y la supervivencia de las preparaciones, el uso de tejido humano, y / o el uso de productos químicos caros. También proporciona una manera de investigar las propiedades de cada componente de la vejiga (es decir, músculo liso, la mucosa, los nervios) en condiciones saludables y patológicos.

La vejiga urinaria se retira de un animal anestesiado, se colocó en solución de Krebs y cortar en tiras. Las tiras se colocan en una cámara llena con solución caliente de Krebs. Un extremo está unido a un tensio isométrican transductor para medir la fuerza de contracción, el otro extremo está unido a una varilla fija. El tejido se estimuló mediante la adición de compuestos directamente al baño o electrodos de estimulación de campo eléctrico que activan los nervios, similar a la activación contracciones de la vejiga in vivo. Se demuestra el uso de este método para evaluar la contractilidad del músculo liso espontánea durante el desarrollo y después de una lesión de la médula espinal experimental, la naturaleza de la neurotransmisión (transmisores y receptores implicados), factores implicados en la modulación de la actividad del músculo liso, el papel de los componentes individuales de la vejiga, y las especies y las diferencias de órganos en respuesta a los agentes farmacológicos. Además, podría ser utilizado para la investigación de las vías intracelulares implicadas en la contracción y / o la relajación del músculo liso, relaciones estructura-actividad de la droga y la evaluación de la liberación del transmisor.

El método de la contractilidad del músculo liso in vitro se ha utilizado ampliamente for más de 50 años, y ha proporcionado datos que han contribuido significativamente a nuestra comprensión de la función de la vejiga, así como para el desarrollo farmacéutico de los compuestos que se utilizan actualmente para el manejo clínico de la vejiga.

Introduction

El músculo liso de la vejiga se relaja para permitir el almacenamiento de la orina, y contratos para provocar la eliminación de orina. Relajación es mediado por las propiedades intrínsecas del músculo liso y por la liberación tónica de norepinefrina (NE) de los nervios simpáticos, que activa los receptores adrenérgicos beta (β 3 AR en humanos) en el detrusor. La micción se logra mediante la inhibición de la entrada simpática y la activación de los nervios parasimpáticos que la liberación de ACh / ATP se contraiga el músculo liso de la vejiga 1. Numerosos estados patológicos, incluyendo el cerebro y / o lesión de la médula espinal, enfermedades neurodegenerativas, diabetes, obstrucción de la salida de la vejiga o cistitis intersticial, pueden alterar profundamente la función de la vejiga, con graves repercusiones en la calidad de vida del paciente 2. Estas condiciones alteran la contractilidad del músculo liso al afectar a uno o más componentes de la vejiga: el músculo liso, el aferente o nervios eferentes y / o lamucosa.

Varios in vivo y métodos in vitro para estudiar la función de la vejiga se han desarrollado. In vivo, cistometría es la principal medida de la función de la vejiga. Aunque esta es una preparación intacta que permite la recogida de información en virtud próximo a las condiciones fisiológicas, hay una serie de circunstancias en las que se prefiere el uso de tiras de músculo liso. Estos incluyen situaciones en las técnicas quirúrgicas y / o manipulaciones farmacológicas que puedan afectar a la supervivencia y la estabilidad de la preparación in vivo, o cuando los estudios requieren el uso de tejido humano o productos químicos caros. Este método también facilita un examen de los efectos de los fármacos, la edad y la patología en cada componente de la vejiga, es decir, el músculo liso, mucosa, aferentes y nervios eferentes.

Tiras de vejiga se han empleado en los últimos años por muchos grupos para responder a una serie de preguntas científicas. Estaban acostumbrados a evaluate cambios en la actividad espontánea miogénica inducida por la patología. Se cree que esta actividad para contribuir a los síntomas de urgencia y frecuencia de la vejiga hiperactiva (OAB), y por lo tanto es una diana para fármacos se están desarrollando para OAB 3-9. Tiras de vejiga también se utilizaron para investigar los factores miogénicas y neuronales que modulan el tono del músculo liso con el objetivo de descubrir los canales iónicos y / o receptores y / o vías intracelulares que podrían ser objeto de inducir la relajación o contracción del músculo liso 3,10- 13. Otros estudios se han centrado en la naturaleza de la neurotransmisión, incluyendo transmisores y receptores implicados y los cambios inducidos por la patología 14,15. Además, el método ha sido utilizado para las comparaciones entre los tejidos de diferentes especies jóvenes de 16 18, entre los órganos 19-21, y la evaluación de las relaciones estructura-actividad de drogas 22-24. Una extensión de este método ha sido utilizado para Measure el efecto de los fármacos sobre la liberación del transmisor de los nervios eferentes 25. Además, una variedad de tejidos (vejiga, la uretra, el tracto gastrointestinal, GI) cosechado de animales o seres humanos (de cirugías o tejido de un donante de órganos aprobados para investigación) y de una variedad de modelos animales, incluyendo lesión de la médula espinal (SCI), obstrucción de la salida de la vejiga (BOO), o la cistitis intersticial (IC) pueden ser investigados mediante esta técnica.

En este artículo se expone la aplicación de este método, junto con los protocolos experimentales necesarios, para abordar varias cuestiones científicas antes mencionadas.

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Protocol

Todos los procedimientos descritos aquí son aprobados por el comité de IACUC en la Universidad de Pittsburgh.

1. Soluciones

  1. Preparar la solución de Krebs de acuerdo a la receta. Composición en mM: NaCl 118, KCl 4,7, CaCl2 1,9, MgSO4 1,2, NaHCO3 24.9, KH 2 PO 4 1.2, dextrosa 11.7.
  2. Airear Krebs con un 95% de O 2, 5% de CO 2 y colocarlo en un baño de 37 º C el agua que se utilizará durante todo el experimento. Coloque de lado ~ 200 ml de solución de Krebs aireado a temperatura ambiente que se utilizarán para la disección de tejidos.
  3. Medir pH (~ 7.4) y la osmolaridad (~ 300 mOsm) de aireado Krebs.

2. experimental (Figura Esquema 1A)

  1. Rellene aireado (95% O 2, 5% de CO 2) cámaras con 10 ml de Krebs.
  2. Encienda la bomba de circulación de agua para calentar las cámaras de hasta 37 ° C; encender el equipo necesario: amplificador (s), estimulador (s) y grabación de software.
  3. Calibrar transductores con un 1 g de peso.

3. tisular (Figura 1B)

Retire la vejiga de un Sprague Dawley adultas ingenuo hembra (200-250 g; ~ 10-12 semanas de edad) siguiendo estos pasos:

  1. Prepare el área de disección y los instrumentos necesarios: máquinas de afeitar eléctricas, pinzas con dientes, hoja de bisturí, tijeras de disección, micro tijeras, dos pinza de disección (autores prefieren Dumont fórceps # 3), clips de tejido (o sutura de seda), un plato de disección Sylgard recubiertos con Krebs y alfileres de disección de tejidos.
  2. Anestesiar al animal con la inhalación de isoflurano (4% en O 2) en la cámara de inducción. Use pomada veterinaria en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. Controlar continuamente el nivel de anestesia mediante la observación de la tasa de respiración, la respuesta a los estímulos externos, y la pérdida de la extremidad trasera retirar reflejo.
  3. Cuando el animal se anestesia el afeitado una baja del abdomenrea. Exponer los órganos de la pelvis a través de una incisión abdominal en la línea media. Identificar la vejiga y la uretra. Retire la vejiga por el corte en el cuello de la vejiga cerca de la uretra proximal. Coloque tejido inmediatamente en el plato recubierto Sylgard lleno con solución de Krebs aireada.
  4. Si es necesario, retire el tejido adicional en este momento: la uretra, piezas de gastrointestinal (GI) y / o de la próstata, etc
  5. Sacrificio del animal utilizando métodos aprobados IACUC (por ejemplo, por sobredosis de anestésico o asfixia de CO 2 seguido de un método secundario).
  6. Inserte pernos de tejido a través de la disección de la cúpula vesical, el cuello y los uréteres, para estabilizar el tejido para su posterior disección. No estire el tejido. Retire, tejido graso conectivo, la uretra proximal, y uréteres si están presentes.
  7. Abra la vejiga desde la base hasta la cúpula para crear una hoja plana, lado serosa abajo / lado luminal (Figura 1B). Coloque pasadores de disección en cada esquina del tejido. Retire dom vejigaE y tejido del cuello.
  8. Si el propósito del experimento es determinar la contribución de la mucosa (urotelio y lámina propia - véase el diagrama de la Figura 1C) a la contracción del músculo liso, comparar las propiedades de las tiras del detrusor con y sin la mucosa unida. Para ello, antes de cortar el tejido en tiras, retire con cuidado la capa de la mucosa utilizando iris primavera tijeras y pinzas finas bajo un microscopio de disección. Al final del experimento, fijar las tiras para la tinción H & E para confirmar la eliminación completa de la mucosa. Tenga en cuenta que este procedimiento es más fácil en la vejiga del ratón que en vejiga de rata.
  9. Cortar el tejido a lo largo de la base de la cúpula en tiras de ~ 2 x 8 mm (Figura 1B). Ate o adjuntar un clip de tejido a ambos extremos de cada tira.
    NOTA: Una vejiga de rata por lo general se puede cortar en tiras 4, pero el número de tiras puede aumentar o disminuir dependiendo del tamaño del animal / vejiga.
  10. Transferir las tiras a la expercámaras imental. Una un extremo de cada tira a un transductor de fuerza, que mide la contracción del tejido, y el otro a una varilla de vidrio / de metal fijo.
    NOTA: cámaras de tejidos varían en tamaño (0,2 ml a 20 ml o más). Cámaras típicas para vejigas de roedores son 5-20 ml, que proporcionan una altura suficiente para que las tiras se sumergieron completamente en la solución. Algunas cámaras vienen con una función de electrodos de estimulación, no otros. Se debe tener cuidado para asegurar que todas las conexiones de los electrodos están en buen estado, de lo contrario la estimulación de campo eléctrico no es confiable.
  11. Aplicar una cantidad definida de la fuerza para cada tira por el estiramiento suavemente el tejido hasta que la tensión alcanza la línea de base 1 g (~ 10 mN). Inicialmente, el tejido tiende a relajarse, que se registra como una disminución en la tensión de línea de base. Lavar el tejido aproximadamente cada 15 min usando la cálida Krebs aireado y ajustar la tensión de la línea de base a 1 g después de cada lavado. Deje que el tejido se equilibre durante ~ 1-2 horas o hasta que la tensión de línea de base es estable (es decir, hay una mayor relajación del tejido).
  12. Se alcanza prueba la viabilidad del tejido mediante la adición de KCl (80 mM) directamente al baño para ~ 5 min, o hasta que una respuesta meseta. Las respuestas a altas concentraciones de KCl también se pueden repetir durante el experimento o al final del experimento y se utilizan para la normalización de las respuestas a otros fármacos o entre las tiras (véase la normalización en la sección de análisis de datos).
  13. Tejido Lavar varias veces (3-5x) con la tibia aireada Krebs para permitir que los tejidos regresen a las condiciones pre-tratamiento.

4. Estimulación Protocolos

  1. Para investigar los efectos de la patología en la actividad miogénica espontánea o tono del músculo liso, utilizar tiras de músculo liso de diferentes modelos animales, tales como SCI, BOO, o neonatos. Figura 2 ilustra el uso de este método para investigar los cambios en la actividad espontánea de la vejiga durante el desarrollo y después de la lesión. Además, los agentes farmacológicos pueden ser utilizados para modular spactividad ontaneous. Figura 3 ilustra el efecto de los moduladores del canal KCNQ, flupirtina y XE991, sobre la actividad espontánea y tono del músculo liso.
  2. Para constructo estimulación muscular curvas de respuesta de concentración lisas farmacológicas mediante la adición de compuestos a partir de soluciones madre concentradas directamente al baño a intervalos de tiempo definidos. El consumo de drogas y el vehículo en bandas paralelas para dar cuenta de los efectos de los vehículos y de tiempo.
    1. Haga soluciones madre de los compuestos de ensayo deseados a 1000x la concentración de trabajo final. Para carbacol (CCh), un agonista de los receptores muscarínicos, preparar siguientes poblaciones: 10 -5 M, 3 x 10 -5 M, 10 -4 M, 3 x 10 -4 M, 10 -3 M, 3 x 10 -3 M , 10 -2 M. Las concentraciones finales en el baño es de 10 -8 M a 10 -5 M (Figuras 4C, D). Para neuromedina B (NMB), un receptor de bombesina subtipo 1 agonista, preparar siguientes poblaciones: 10 -8 M, 10 -7M, 10 -6 M, 10 -5 M, 10 -4 M, 10 -3 M y concentraciones finales en el baño son 10 -11 M a 10 -6 M. Se espera que tanto CCh y NMB para aumentar la contractilidad del tejido.
    2. Para un baño de tejido de 10 ml, añadir 10 l de cada solución madre CCh tan pronto como la respuesta alcanza una meseta (Figura 4C, D). En tiras paralelas añadir la misma cantidad de vehículo (agua). Del mismo modo, añadir 10 l de cada solución neuromedina B ~ acción cada 5 min.
      NOTA: Observar el efecto excitatorio de NMB y CCh en tono del músculo liso en tiras de diferentes especies en la Figura 4.
    3. Investigar las propiedades de relajación de los músculos lisos en los tejidos pre-contrato con un agente excitador, por lo general CCh o KCl.
    4. Para bloquear una respuesta agonista, pretratar el tejido durante 10-20 min con el antagonista para permitir la penetración del tejido, antes de la estimulación agonista.
  3. Por estimulación neuralulación del músculo liso, también llamada estimulación de campo eléctrico (EFS) siga los pasos 1 a 3.13 y continuar como se describe a continuación. EFS está destinado a activar selectivamente los nervios frente del músculo liso. Parámetros para la estimulación deben ser elegidos cuidadosamente para evitar la estimulación directa del músculo liso.
    1. Establecer parámetros de estimulación: tipo de estímulo (pulsos individuales o trenes), la duración (duración del pulso y la duración de tren), la frecuencia y la intensidad, como se describe en los pasos a continuación y se ilustra en las figuras 5A, B.
      1. Para sola estimulación de pulso, set duración del pulso, intervalo entre el estímulo y la cantidad de estímulos deseados. Habituales parámetros de duración de estimulación son pulsos individuales de 0,05-0,3 mseg de duración entregado a intervalos deseados (Figura 5A). Siga el paso 4.3.1.4 de la intensidad del estímulo.
      2. Para la estimulación de tren, establecer la duración de trenes y el intervalo entre trenes. Los valores típicos de tejido de la vejiga son 3-10 seg entregados al menos 1 men aparte (Figura 5B). Si se produce la fatiga del tejido (es decir EFS contracciones disminuyen durante el período de control), aumentar el intervalo entre trenes.
      3. Establecer la frecuencia de los trenes de estímulos (número de pulsos de un tren - Figura 5B). Ejecutar una curva de respuesta de frecuencia que va desde 0,5 hasta 50 Hz. Frecuencias típicas para la vejiga son 10-20 Hz, que dan contracciones reproducibles y estables mediadas por ATP y ACh. Observar las respuestas dependientes de la frecuencia a la estimulación EFS en tiras de vejiga del ratón en la Figura 5 demuestran cómo este método se puede utilizar para evaluar la contribución de los mecanismos colinérgicos y purinérgicos a la neurotransmisión.
      4. Establecer intensidad del estímulo: aumentar sistemáticamente la intensidad (voltaje) del estímulo hasta que la amplitud de la contracción alcanza una meseta (si se utiliza trenes de mantener constante la frecuencia).
      5. Ajuste la intensidad del estímulo en función de laobjetivo del experimento. Si el objetivo es aumentar las contracciones neuralmente evocada, a continuación, utilizar la intensidad submáxima de manera que la amplitud de la contracción es de ~ 50% de la contracción máxima. Si el objetivo es disminuir las contracciones neuralmente evocada, a continuación, establezca la intensidad de ~ 80% de la amplitud máxima para evitar la fatiga del tejido.
    2. Una vez establecidos los parámetros de estimulación (duración, frecuencia e intensidad), permitirá a ~ 20-30 min para EFS- evocó las contracciones se estabilice antes de la prueba de drogas.
      NOTA: Para verificar la selectividad de EFS para la transmisión neuronal, bloque de transmisión neuronal con el bloqueador de los canales de Na +, la tetrodotoxina (TTX; 0,5-1 M). Realice este paso al comienzo del experimento, como TTX lava relativamente fácil. Además, realizar esta al final del experimento (véase el paso 4.3.5. Abajo).
    3. Preparar soluciones madre a las concentraciones de trabajo 1,000x finales para: alfa, beta-ATP de metileno (ABMA; un activador del receptor purinérgicoy desensibilizante) 10 -2 M, atropina (un antagonista del receptor muscarínico) 10 -3 M (Figura 5C). Observe otros ejemplos en la Figura 6. El agonista del receptor 5HT4, cisaprida (3 x 10 -6 M, 10 -6 M, 3 x 10 -5 M, 10 -5 M, 3 x 10 -4 M, 10 -4 M, 3 x 10 -3 M, 10 -3 M), aumenta la contractilidad del tejido y SB-203186 (3 x 10 -3 M), un antagonista del receptor 5HT4, invierte los efectos de la cisaprida.
    4. Para probar los efectos de la ABMA y atropina en EFS (Figura 5C), realizar dos curvas de respuesta de frecuencia de control. Añadir 10 l de 10 -2 M ABMA al baño para una concentración final de 10 mM. Esto se contraerá el tejido debido a la estimulación directa de los receptores purinérgicos en el músculo liso. Después de la respuesta vuelve a la línea de base, repetir las curvas de respuesta de frecuencia. Añadir 10 l de 10 -3 M de atropina para un concentrat definitivaion de 1 mM. Después de ~ 10 min (necesario para la atropina para bloquear los receptores muscarínicos), repetir las curvas de respuesta de frecuencia. En tiras paralelas añadir 10 l de vehículo, agua, en cada paso.
      NOTA: Para otros ejemplos en la Figura 6, añadir 10 l de cada solución de stock cisaprida a intervalos definidos de tiempo (~ cada 15 min; véase la discusión), seguido por 10 l de SB-203186 de stock solución directamente al baño y vigilar su efecto en contracción EFI inducida. En tiras paralelas añadir 10 l de vehículo, DMSO. Observar los efectos de la cisaprida, un agonista del receptor 5HT4, sobre las contracciones evocadas-EFS en los tejidos de la vejiga e íleon humanos en la Figura 6. Además, observe el efecto de DMSO, el vehículo de la cisaprida, el EFS evocados contracciones en la vejiga humana y tejidos íleon .
    5. Al final del protocolo de EFS verificar la selectividad de EFS mediante el bloqueo de la transmisión neural con el bloqueador del canal de Na +, tetrodotoxina (TTX; 0,5-1 y# 181; M). Si las contracciones resistentes a TTX están todavía presentes, se recomienda ajustar la duración y la intensidad del estímulo en experimentos posteriores.
  4. Para determinar los efectos de los fármacos en los sitios pre o post-sináptica (Figura 7A) siga los pasos 1 a 4.3.2. Establecer respuestas reproducibles al carbachol y EFS, a continuación, añadir la droga X.
  5. Al final del experimento, desenganchar o desatar las tiras, secar suavemente sobre un trozo de papel de seda para eliminar el exceso de líquido y medir el peso de cada tira con una balanza. También mida la longitud del tejido usando un calibrador para determinar el área de la sección transversal. Esta información se utiliza para la normalización de los datos (ver sección 5.4).

Análisis 5. Datos

Analizar datos utilizando el software adecuado (por ejemplo, Windaq, LabChart).

  1. Para la actividad espontánea, seleccione una ventana de al menos 30 segundos antes y en el pico de la respuesta inducida por drogas y measure amplitud y frecuencia de la actividad miogénica (Figura 3).
    1. Utilice el análisis de transformación rápida de Fourier para determinar el espectro de frecuencias que contribuyen a respuestas contráctil y si hay diferencias entre las diferentes partes de la vejiga (por ejemplo, la cúpula vs. cuello) o con el desarrollo, patología, y las drogas 8.
  2. Para efectos sobre el tono del músculo liso seleccionar una ventana de al menos 10-30 segundos antes y en el pico de la respuesta inducida por fármacos y medir la amplitud de la contracción.
  3. Para efectos sobre las contracciones neuralmente evocadas-medir la amplitud, la duración y el área bajo la curva de las contracciones (al menos 3) antes y en el pico de la respuesta inducida por fármacos.
    NOTA: Es necesario medir tanto la amplitud y el área bajo la curva de las contracciones inducidas por EFS porque los componentes purinérgicos y colinérgicas tienen diferentes cinéticas. El componente purinérgico es rápido y transitorio (ATP activa purinergic ionotrópicos canales tales como P2X1 que permiten afluencia rápida de calcio, entonces se insensibilizan), contribuyendo así más a la respuesta de amplitud de pico y menos para el área bajo la curva. El componente colinérgico es más lenta y sostenida (ACh activa los receptores muscarínicos metabotrópicos, que requieren más tiempo para activar las vías intracelulares que en última instancia, activan canales iónicos que despolarizan del músculo liso para inducir una contracción). Por lo tanto, el componente muscarínico se captura mejor midiendo el área bajo la curva.
  4. Normalizar los datos para poder comparar los resultados entre los tiras y tratamientos farmacológicos. El parámetro elegido para la normalización no debe estar influenciada por los compuestos de ensayo, condición patológica o estudió diseño experimental. Entre estos parámetros, el peso utilización tira, área de la sección transversal, las respuestas de KCl (Figura 4B),% de la respuesta máxima (Figura 7B) o% de la respuesta máxima a otro agente contráctil(Por ejemplo, CCh) o agentes de relajación (por ejemplo, papaverina).

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Representative Results

Actividad Myogenic espontánea

Actividad miogénica espontánea es una característica importante del músculo liso que sufre cambios con el desarrollo postnatal 6-9 y patología (por ejemplo, SCI, BOO) 3-5. Como se cree que esta actividad para contribuir a los síntomas de la vejiga hiperactiva (OAB) 2, una evaluación de los receptores, vías intracelulares y agentes farmacológicos que modulan ella, es de gran interés para el desarrollo de tratamientos eficaces para la OAB y otras disfunciones musculares lisas. El método presentado aquí puede investigar fácilmente estas preguntas Figura 2 ilustra diferentes patrones de actividad espontánea miogénica durante el desarrollo en neonatal (i), juvenil (ii) adulto (iii) y ratas de la médula espinal lesionada. (SCI; iv). Tiras de ratas recién nacidas muestran gran amplitud, las contracciones rítmicas de baja frecuencia (Figura 2AI), mientras que las tiras de rata adultas exhiben pequeña amplitud, alta frecuencia de la actividad (Figura 2AII iii,). Después de SCI el patrón neonatal resurge (Figura 2Aiv). Además de usar tiras de modelos animales, diversos agentes farmacológicos se pueden usar para inducir contracciones espontáneas en tiras procedentes de animales naive, con el objetivo de comprender los mecanismos que subyacen a las contracciones espontáneas. Ejemplos de agentes farmacológicos adecuados incluyen agonistas muscarínicos de los receptores (carbacol; CCh)., Compuestos que aumentan los niveles de ACh (tales como inhibidores de la esterasa de acetilcolina), bajas concentraciones de KCl (por ejemplo, 20 mM) u otros fármacos experimentales Figuras 3A-B, ilustran la modulación de la actividad espontánea de los agentes farmacológicos que actúan en los canales de KCNQ situados en el músculo liso. La apertura del canal KCNQ, flupirtina, disminuye la amplitud y frecuencia de la actividad espontánea de una manera dependiente de la concentración (Figura 3AI-iii), mientras que elBloqueador de los canales KCNQ, XE991, disminuye la amplitud, pero aumenta la frecuencia de la actividad espontánea (Figura 3Bi-iii).

Tono del músculo liso

Propiedades tono del músculo liso y la contractilidad son factores importantes para el correcto funcionamiento de la vejiga durante el almacenamiento y evacuación. Este método puede detectar fácilmente los efectos de los agentes farmacológicos sobre el tono del músculo liso. Figuras 3Aiv y 3Biv muestran que la flupirtina disminuye el tono basal, en consonancia con la relajación del músculo liso, mientras que el tono del músculo liso aumenta XE991. La Figura 4 ilustra concentración aumenta dependientes en tono del músculo liso mediante la activación de los receptores de bombesina con neuromedina B (NMB; Figura 4A, B) o receptores muscarínicos con carbacol (CCh; Figuras 4C, D). Además, las vías intracelulares que median estas respuestas musculares lisas pueden ser investigados ucantar moduladores específicos (datos no mostrados).

Respuestas neuromediado y modulación de la neurotransmisión

Contracción de la vejiga se logra mediante la liberación de ACh / ATP a partir de los nervios eferentes parasimpáticos. La contribución de los sistemas muscarínicos y purinérgicos a la contracción de la vejiga varía entre las especies y condiciones patológicas, con un aumento en la contribución predominante purinérgico en patologías tales como la cistitis intersticial, obstrucción de la salida parcial, y la vejiga hiperactiva 26. Figura 5C muestra el uso de este método para determinar la contribución de los componentes muscarínicos y purinérgicos de neurotransmisión en tiras de vejiga del ratón. La contribución del componente colinérgico se evaluó mediante el antagonista de los receptores muscarínicos, atropina. La contribución del sistema purinérgico se evaluó mediante el activador del receptor purinérgico y desensibilizante, alfa, beta-metileno ATP (ABMA). Además, la contribución dependiente de la frecuencia de cada componente se evaluó mediante la variación de la frecuencia de estimulación de baja a altas frecuencias (2-50 Hz).

La fuerza de la contracción de la vejiga juega un papel significativo en la micción de manera eficiente. Usando este método, receptores y vías que modulan la transmisión neural pueden ser investigadas como dianas de fármacos para anular disfunciones. Los receptores 5HT4 se expresan pre-junctionally en las neuronas parasimpáticas y su activación aumenta los niveles de ACh 27. Figura 6 ilustra el efecto excitador del agonista del receptor 5HT4, cisaprida, en tiras de vejiga e íleon humanos.

Varios protocolos experimentales se pueden emplear para determinar el sitio de acción de un compuesto de ensayo. Diagrama de la Figura 7A ilustra un protocolo utilizado para evaluar pre vs post-sitios de unión. Si la droga X reduce (o aumenta) la respuesta EFS pero no tiene efect en la respuesta CCh, el sitio más probable de acción es pre-unión. Si la droga X altera tanto la respuesta EFS y CCh, entonces puede actuar sobre los receptores situados post-junctionally o ambos antes y después de junctionally.

Función de cada componente: músculo liso, la mucosa, y Neuronal

Diferentes condiciones patológicas pueden afectar a diversos componentes de la vejiga. Por ejemplo cistitis intersticial (IC) afecta principalmente a la urotelio, mientras OAB puede resultar en la contractilidad del músculo liso alterada. Además, los diferentes receptores pueden ser expresados ​​en cada componente de la vejiga y por lo tanto podrían ser dirigidos específicamente en una determinada patología. A diferencia de los métodos in vivo, que miden un efecto neto de todos los componentes de la vejiga, este método in vitro permite la investigación de los componentes particulares mediante el uso de una combinación de procedimientos quirúrgicos y farmacológicos. Para probar músculo liso contracción / relajación en ausencia de neuronaltransmisión, TTX (0,5-1 M) se pueden añadir al baño. En la Figura 4, NMB y CCh se probaron en presencia de TTX. Para probar la contribución de la mucosa (urotelio y lámina propia) a la contractilidad del músculo liso, se comparan las tiras con y sin la capa de la mucosa. Figura 7B muestra que las respuestas a CCh se reducen en presencia de la mucosa en el cerdo 28. Resultados similares fueron reportados en tiras de vejiga humanos 29. Para probar el papel de las fibras nerviosas, varios enfoques pueden ser tomados. Uno es para activar o inhibir las fibras específicas utilizando agentes farmacológicos. Por ejemplo, la capsaicina activa una población específica de los nervios aferentes y causa especies contracción del músculo liso dependiente o relajación 17,18. Guanetidina inhibe la liberación de norepinefrina de las fibras simpáticas, eliminando así la contribución de estas fibras. Otro enfoque es para desensibilizar / eliminar fibras específicas in vivoantes del experimento. Por ejemplo, el tratamiento sistémico del animal con capsaicina desensibiliza la capsaicina nervios aferentes sensibles. Otros componentes de la vejiga que se pueden estudiar en esta preparación son células intersticiales o uniones gap activando o bloqueando con agentes específicos.

Las diferencias entre especies

Mientras que la mayoría de desarrollo de fármacos se destina para el tratamiento de trastornos humanos, la investigación básica se lleva a cabo principalmente en el tejido animal. Existen diferencias entre especies en un número de receptores. Por ejemplo, los agonistas del receptor 5HT4 mejorar las contracciones neuralmente evocadas en la vejiga humana pero no en la vejiga de rata 19,30, inducida por EFS contracciones son casi exclusivamente sensible atropina en detrusor humano y de mono del viejo mundo de vejigas estables 31 pero se vuelven parcialmente resistente a la atropina en detrusor humano de pacientes con condiciones inestables de la vejiga (por ejemplo, neurogénica, obstructevejigas d) 15,32,33, la capsaicina provoca una respuesta excitatoria en tiras de vejiga de rata y humano, no hay respuesta en tiras de vejiga de cerdo y respuesta inhibitoria en tiras de vejiga de cobaya 17,18. Figura 4 muestra que los agonistas del receptor de bombesina tener efectos excitatorios en vejiga de rata y efectos en ratones y de vejiga de cerdo tiras 16. Esta información es crítica para la selección del modelo animal adecuado para el estudio de un receptor específico.

Comparación de la sensibilidad a través de Órganos

Medicamentos destinados para el tratamiento de trastornos de la vejiga también pueden afectar el músculo liso de otros órganos, como el tracto gastrointestinal, la uretra, la vesícula biliar, etc Este método permite la estimación de la selectividad de órganos y la sensibilidad a un agente farmacológico mediante la comparación de diferentes tejidos de lado a lado. Como se ilustra en la Figura 6, el agonista del receptor 5HT4, cisaprida, ha diferireficacia ent y la potencia en la vejiga humana vs tejido íleon.

Figura 1
Figura 1. Experimental set-up y tiras de vejiga preparación. A) Representación esquemática de la instalación experimental. Tiras de vejiga se sumergieron en cámaras de tejido llenas de solución de Krebs aireado mantuvo a 37 ° C a través de una bomba de circulación de agua. Un extremo de la tira está conectado a un transductor de fuerza isométrica para medir la contractilidad del tejido, y el otro a una varilla fija. El transductor de fuerza está conectado a un amplificador y un ordenador para la grabación de datos. Electrodos de estimulación de campo eléctrico conectado a un estimulador se colocan en la cámara y se utilizan para evocar contracciones de la vejiga neuromediado. B) Preparación de tiras de tejido. La vejiga se inmovilizó en un plato y se llevan a cabo los siguientes procedimientos: # 1 º corte verticalough media ventral de la vejiga de la uretra a la bóveda para abrir la vejiga a una lámina plana. # 2 cortes horizontales eliminación de la cúpula y la base de la vejiga / uretra proximal. Eferentes (verde) nervios del músculo liso y la mucosa, que contiene tanto aferente (azul) y:. # 3 cortes verticales que dividen mediados de la vejiga en tiras iguales (4 tiras de una vejiga de rata) C) Esquema de los componentes de la tira. Mucosa consiste en el urotelio y la lámina propia. Lámina propia contiene vasos sanguíneos [1], las células intersticiales [2], y la muscular de la mucosa [3]. La línea punteada etiquetada # 2b indica el procedimiento para la eliminación de la capa mucosa. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. actividad espontánea miogénica durante el desarrollo y después depatología. A) Ejemplos de actividad espontánea en neonatal (i), juvenil (ii), adulto intacto espinal (iii) y la médula espinal lesionada (SCI) adulto (iv) tiras de vejiga de rata. La rata SCI se utilizó a las 4 semanas después de la cirugía. B, C) ​​Resumen de la amplitud (B) y la frecuencia (C) de las contracciones espontáneas en los cuatro grupos investigados. (Reproducido con permiso de Artim DE, Kullmann FA, Daugherty SL, Bupp E, Edwards CL, de Groat WC Neurourol Urodyn 2011 Nov; 30 (8):.. 1666-1674.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de este figura.

Figura 3
Figura 3. modulación de la actividad espontánea miogénica y el tono del músculo liso. A) El efecto de la apertura del canal KCNQ, Flupirtine, sobre la actividad espontánea y el tono basal en tiras de vejiga de rata adulta. (I) La flupirtina se añadió en concentraciones crecientes (acumulativas) en los tiempos indicados por las flechas. Las ampliaciones bajo la traza espectáculo 4 min de la actividad de Gaza durante el control y después de la aplicación de 10 M y 50 M flupirtina. (Ii-iv) Resumen de los efectos de flupirtina (7 tiras de 4 ratas) de la amplitud (ii) y la frecuencia (iii) de la actividad espontánea y el tono basal (iv), expresado como% de cambio a partir de los valores de control (pre-drogas) , que se fijaron a 100%. B) El efecto de la bloqueador de los canales KCNQ, XE991, sobre la actividad espontánea y el tono basal en tiras de vejiga de rata adulta. (I) XE991 se añadió en concentraciones crecientes (acumulativas) en los tiempos indicados por las flechas. Las ampliaciones bajo la traza muestran 2 min de la actividad durante la franja de control y después de la aplicación de 10 M y 50 M XE991. (Ii-iv) Resumen de los efectos de XE991 (9 tiras de 4 ratas) en laamplitud (ii) y la frecuencia (iii) de la actividad espontánea y el tono basal (iv), expresado como% de cambio de los valores de control (pre-drogas), que se establece en 100%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra .

Figura 4
Figura 4. las diferencias entre especies. Contracciones del músculo liso dependientes A) Concentración en respuesta al agonista del receptor de bombesina, neuromedina B (NMB), en tiras de vejiga de rata. B) Resumen de los efectos de NMB en la contracción del músculo liso en las tiras de vejiga de rata. Se normalizaron los datos a la KCl (80 mM) de respuesta. C, D) Ausencia de respuestas a NMB en ratón (C) y de cerdo (D) tiras de vejiga. Carbachol (CCh) provoca la concentración fuerte aire dependetracciones en ambas tiras de ratón y cerdo, lo que indica que las tiras pueden responder a estímulos. TTX (0,5 M) estuvo presente en el baño en todas las tiras. (Reproducido con permiso de Kullmann FA, McKenna D, Wells GI, Thor KB neuropéptidos 2013 Oct; 47 (5):.. 305-13) Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. estimulación del campo eléctrico. A) Esquema de los parámetros individuales de estimulación de pulso. Abreviaturas: d = duración de pulso, i = intensidad de pulso, ipi = inter pulso intervalo B) Esquema de parámetros de estimulación en tren.. Abreviaturas: duración td = tren, i = intensidad de pulso, iti = intervalo entre trenes. El recuadro muestra el número de pulsos de un tren y el intervalo between ellos, que junto con la duración de tren determinar la frecuencia de estimulación de tren. C)   Contribución de los componentes purinegic y colinérgicas a-evocó neural contracciones de la vejiga. EFS-FR representan las frecuencias de estimulación, 2, 5, 10, 20, 50 Hz. Tres estímulos entregados cada 90 seg se probaron para cada frecuencia y la frecuencia de cada serie se repitió dos veces en el control y dos veces después de la adición de cada compuesto. Alfa, beta-ATP de metileno, abreviado ABMA (banda 1), se utilizó para desensibilizar los receptores purinérgicos y atropina (banda 2) se utilizó para bloquear los receptores muscarínicos. Strip 3 sirvió como control y fue tratada con el vehículo, agua. Las flechas indican el momento en que se añadió cada compuesto a cada tira. Tenga en cuenta que las contracciones evocadas-EFS están fuertemente reducidos por ABMA y atropina, mientras que no se ve afectado por el vehículo. TTX fue añadido al final del experimento, mientras que la EFS se administró a 20 Hz. Tenga en cuenta que las contracciones restantes observados en el controltira 3 fueron abolidos por TTX, demostrando su naturaleza neural (es decir, iniciado por la liberación del transmisor de los nervios intramurales). # Indica las respuestas del músculo liso a ABMA en ausencia de EFS. Las barras de escala son 5 min para el eje x y 2 g para el eje y. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. Modulación de contracciones de la vejiga neuralmente evocadas. A, B) Ejemplos de la mejora de las contracciones neuralmente evocadas por el agonista del receptor 5HT4, cisaprida en la vejiga humana (A) y las tiras de íleon (B). La cisaprida (registros negros) o DMSO (registros de grises) se añadió de una manera dependiente de la concentración en los tiempos indicados por las flechas. Las barras negras por debajo de los registros en cada panelrepresentan EFS, que consistía en 10 seg trenes entregados en 20 Hz cada 120 seg. Las barras verticales de escala son 1 g para todos los ejemplos. Concentración de TTX fue de 0,5 M. CF) Resumen del área bajo la curva (AUC) de las contracciones evocadas-EFS en respuesta a la cisaprida (barras negras) o DMSO (barras grises) en tiras de vejiga (C, D) y las tiras de íleon (E , F). En la FQ, SB significa SB-203186, que representa un resumen de los datos obtenidos después de la adición del antagonista del receptor 5HT4. Las líneas de puntos se establecen en 100% y representan control. (Reproducido con permiso de Kullmann FA, Kurihara R: Vosotros L, Wells GI, McKenna DG, Burgard CE, Thor KB Auton Neurosci 2013 Jun; 176 (1-2):... 70-7) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

Figura 7
Fifigura 7. sitios de acción de las drogas y el papel de los diferentes componentes de la vejiga. A) Esquema de protocolo para identificar el sitio de acción de un fármaco. Las tiras se estimulan con el FSE y el carbacol (CCh). En i fármaco X reduce la respuesta EFS pero no la respuesta CCh, lo que indica un sitio pre-unión de acción. En ii, drogas X altera tanto las respuestas, lo que indica una acción sobre los receptores post-unión o ambos pre y post-unión. B) Influencia de la mucosa en la contracción del músculo liso. Efectos de carbacol están disminuidos en tiras con la mucosa presente (intacta) en comparación con tiras con la mucosa eliminado (denudado). (B se reproduce con el permiso de Hawthorn MH, Chapple CR, Polla M, Chess-Williams R. Br J Pharmacol 2000 Feb; 129 (3):. 416-9). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este trabajo se describe un método simple en la contractilidad del músculo liso in vitro que se puede utilizar para hacer frente a una serie de importantes cuestiones científicas relacionadas con la fisiología y la patología de la vejiga, así como ayudar al descubrimiento de nuevos fármacos para el tratamiento de disfunciones de la vejiga. Hemos ilustrado el uso de este método para la evaluación de las propiedades de desarrollo, patológicas y farmacológicas de la contractilidad del músculo liso de la vejiga (Figuras 2-4), la modulación de la neurotransmisión (Figuras 5-7a), las diferencias entre especies (Figura 4), ​​las diferencias de órganos (Figura 6) y la pertinencia de los componentes de la vejiga específicos (por ejemplo, mucosa, la figura 7B). Aplicaciones adicionales no ilustradas aquí incluyen la evaluación de las vías intracelulares utilizando agentes farmacológicos 3,10,11, relaciones estructura-actividad de diversos fármacos 22-24, o evaluación / cuantificación de rele transmisorase después de estimulación neural 25.

Mientras que la función de la vejiga en última instancia puede evaluarse in vivo, este método in vitro supera muchas situaciones que son problemáticas en vivo. Estos incluyen situaciones en las que las manipulaciones quirúrgicas y farmacológicas reduciría la viabilidad y / o la supervivencia del órgano o el animal, el uso de tejido humano, la necesidad de identificar y caracterizar las respuestas de los componentes específicos (por ejemplo, músculo liso vs. epitelio vs. nervios ) o el uso de productos químicos caros. El método permite la investigación sistemática de los efectos de diversos agentes farmacológicos, así como la patología sobre la actividad contráctil del músculo liso y de una manera bien controlada y el medio ambiente.

El método proporciona una plétora de información; Sin embargo, se debe tener cuidado al interpretar y extrapolar esta información. Este es un método in vitro de una preparación reducida, disconectado de su entorno normal y control neural. Las condiciones experimentales no son fisiológicos, lo que los datos pueden no reflejar totalmente en situaciones fisiológicas in vivo. Por ejemplo, el método no puede dar cuenta de los cambios en el flujo de sangre, hormonas, sustancias humorales, las fuerzas mecánicas externas, control neural o extrínseca. El tejido es sumamente descentralizado, por lo tanto las respuestas de lesión e isquemia relacionada deben ser evaluados y tenidos en cuenta. Los cambios patológicos que ocurren en el cerebro o la médula espinal no se pueden probar usando este método a menos que ya han alterado aferente, músculo liso, mucosa o la función nerviosa intramural (es decir, la plasticidad celular). Estimulación de campo eléctrico (EFS) permite la evaluación de las respuestas neuromediados. Sin embargo, excita indiscriminadamente todos los nervios en la banda (por ejemplo, simpáticas, parasimpáticas, las fibras aferentes), en contraposición a la situación in vivo donde el reflejo de micción se activa sólo pathw en particularays. Una forma de superar esta situación es combinar EFS con antagonistas específicos que bloquean selectivamente diferentes vías. Por ejemplo, guanetidina se podría utilizar para bloquear la liberación de norepinefrina en el estudio de propiedades de contracción, o la atropina podría ser utilizado para bloquear los receptores muscarínicos para evitar contracciones de la vejiga en el estudio de las propiedades de relajación. Por último, la viabilidad del tejido está limitado a un cierto número de horas. En general, la mayoría de los componentes del tejido de la vejiga son viables y estables (es decir, la respuesta a EFS sin deterioro de las respuestas) durante un período de 6-8 horas o más. Sin embargo, otros tejidos pueden ser más sensibles (por ejemplo, íleo dura ~ 6 horas o menos; la experiencia personal del autor).

Aunque el método es técnicamente factible y con buena reproducibilidad, hay varios pasos críticos necesarios para garantizar su éxito. En primer lugar, la preparación del tejido se debe realizar con cuidado para asegurar la viabilidad de hacer los cambios necesariospara el procedimiento de disección (evitar el estiramiento del tejido, mientras que la preparación de las tiras) y / o los medios de comunicación si es necesario para diferentes tipos de tejidos o especies. Otro paso importante es la creación-up parámetros de estimulación neuronal, de tal manera que se eviten efectos techo. Como se describe en la sección de método, esto depende del tipo de experimento llevado a cabo y se espera mecanismo de acción del compuesto de ensayo. Por ejemplo, para probar los efectos de la cisaprida, un agonista del receptor 5HT4, en tiras de vejiga (Figura 6), nos propusimos la amplitud de la contracción evocada-EFS a ~ 50% de la máxima. Esto se basa en el conocido mecanismo de acción de los agonistas del receptor 5HT4, a saber, mejorar la liberación de ACh a partir de los nervios parasimpáticos pre-unión 27, que a su vez se espera que aumenten las contracciones evocadas-EFS. La estimulación de los músculos contra los nervios se debe probar mediante TTX, que inhibe la transmisión neuronal y por lo tanto debe inhibir las contracciones evocadas-EFS. Controles adecuados para vehículo y time debe ser realizado durante la prueba de la droga para tener en cuenta el deterioro de los tejidos con el tiempo y por los posibles efectos del vehículo. Por ejemplo, muchos fármacos se disolvieron en DMSO o etanol. Nuestros datos (Figura 6) muestran que el DMSO (0.1% y superior) puede aumentar las contracciones neuralmente evocadas, un efecto que debe ser restado del efecto del fármaco de ensayo. Del mismo modo, etanol (hasta 1%) reduce las contracciones espontáneas del músculo liso pero no tiene efecto sobre las contracciones neuralmente evocada 34,35. Si el uso de animales genéticamente modificados o modelos quirúrgicos (por ejemplo, lesión de la médula espinal o ovariectomía), los controles deben incluir el tejido de la cepa de ratón fondo apropiado o animales con operación simulada, respectivamente. Además, algunos tejidos, como los humanos, de ratón y cobaya vejigas contienen ganglios intramurales. Al trabajar con estos tejidos, la selección del protocolo y la interpretación de datos deben tener en cuenta los efectos de las drogas o el EFS en ne intramuralurons que estimulan aún más el músculo liso.

Diseñar el protocolo experimental, la elección de los parámetros correctos (por EFS, para la estimulación de drogas) y las concentraciones a ensayar son fundamentales para asegurar que los datos significativos. Mientras que los parámetros deben ser ajustados para los tejidos y las drogas individuales, principios generales / directrices que se describen a continuación son aplicables. Curvas de respuesta de concentración acumulada son deseables, sin embargo esto no es posible para todos los compuestos. Fármacos dirigidos receptores que desensibilizar, tales como los receptores ionotrópicos (P2X purineric), o medicamentos que se metabolizan rápidamente en el tejido (ejemplo ACh), no se pueden probar de forma fiable mediante curvas de concentración-respuesta acumuladas en el mismo tejido. En estos casos, las concentraciones individuales se prueban en diferentes grupos de tejido. Para evaluar la desensibilización, se recomienda para comparar la magnitud de la respuesta provocada por una única concentración más alta a la alcanzada al final de una concentración acumulativacurva de respuesta.

Para el montaje preciso de los datos obtenidos a partir de curvas de concentración-respuesta, es deseable un medio para probar las concentraciones de registro (CCH ejemplo en la Figura 6). Sin embargo, las concentraciones de registro (NMB ejemplo en la figura 4A) son aceptables cuando la viabilidad del tejido puede ser limitada o otros obstáculos pueden estar en su lugar.

Para seleccionar un rango de concentración para un nuevo compuesto, en experimentos preliminares, es útil considerar la afinidad de unión del compuesto de prueba y dos fuentes de alimentación de 10 por encima y por debajo de esa concentración. En experimentos posteriores, el protocolo se refina para determinar un punto de partida, donde se observa ningún efecto del fármaco y un punto final en donde ya sea la respuesta es máxima o la concentración ensayada ya no es específico para el objetivo previsto.

El intervalo de tiempo para la aplicación de un medicamento deberá elegirse tomando en consideración varios factores: a) Tiempo para unamedicamento tenga un efecto. En los medicamentos generales dirigidas a receptores de membrana tiene una respuesta relativamente rápida (segundos a minutos), mientras que los fármacos para dianas intracelulares (por ejemplo, forskolina y otros inhibidores de la enzima 36, la toxina botulínica 37) requiere el tiempo de incubación adicional (30 min - 3 h). Además, el espesor del tejido puede jugar un papel. b) Duración y mecanismo de acción del fármaco. Para casos en que el efecto del fármaco alcanza una meseta que se sostiene, como NMB en la figura 4A y cisaprida en la Figura 6, intervalos de tiempo de 5-15 minutos entre las aplicaciones de medicamentos son adecuados para la recogida de datos suficientes. Esto no es posible con fármacos que tienen una duración mucho más corta de la acción o diferente mecanismo de acción (ATP, CCh). Por ejemplo, el efecto de CCh en la Figura 4C o 4D, alcanza una meseta rápidamente, pero la tensión del tejido tiende a volver a la línea de base. En este caso, los intervalos de tiempo deben ser ajustados de acuerdoLy, generalmente de añadir el siguiente concentración cuando la primera respuesta alcanza un máximo.

Análisis de los datos, en particular la normalización de los datos para permitir comparaciones entre bandas es un paso muy importante. Diferentes estudios utilizan diferentes parámetros para la normalización, incluyendo el peso 38 tira, tira de área de sección transversal 39, la respuesta KCl 12,% de la respuesta máxima o 28% de la respuesta máxima a otro agente contráctil (por ejemplo, CCh 38). El parámetro de normalización debe ser seleccionada dependiendo de la finalidad del experimento, de tal manera que el parámetro no está influenciada por los compuestos de ensayo, patología o el diseño experimental. Por ejemplo, la normalización a la respuesta de KCl elimina el peso y otras dimensiones de las tiras, y por lo tanto podría ser utilizado para comparar las respuestas en los tejidos donde la condición patológica puede aumentar el peso de las tiras (por ejemplo, la diabetes aumenta la masa de la vejiga). Además, la rerespuesta a KCl no está influenciada por la eliminación de la mucosa / urotelio 29, por lo tanto podría ser utilizado en los experimentos que evalúan diferentes componentes de la vejiga (por ejemplo, mucosa frente a los músculos lisos).

En resumen, este método contractilidad proporciona un enfoque rápido, fácil y muy poderosa para evaluar la vejiga (y otros órganos) la fisiología y la farmacología. Cuando se utiliza correctamente, proporciona la capacidad de manipular el tejido en un ambiente reducido y bien controlado. En el estudio de la función de la vejiga urinaria, este método era fundamental en el descubrimiento y el ensayo de compuestos utilizados actualmente para la gestión de OAB, tales como los antimuscarínicos y recientemente desarrollado β 3 AR agonistas.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por el NIH R37 DK54824 y R01 DK57284 subvenciones a LB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Tissue Bath System with Reservoir Radnoti, LLC 159920 isolated tissue baths
Warm water recirculator pump Kent Scientific Corporation  TPZ-749 to keep tissue baths to 37 °C
Computer
Data Acquisiton System DataQ Instruments DI-710-UH To view, record and analyze data
Transbridge Transducer Amplifier World Precision Instruments SYS-TBM4M Transducer amplifier
Grass stimulator Grass Technologies Model S88 Stimulator
Anesthesia System Kent Scientific Corporation  ACV-1205S To anesthetesize the animal
Anesthetizing Box Harvard Apparatus 500116 To anesthetesize the animal
Anesthesia Masks Kent Scientific Corporation  AC-09508 To anesthetesize the animal
Materials and Surgical Instruments
Sylgard Dow Corning Corp 184 SIL ELAST KIT To pin, dissect, & cut tissue
Petri Dish Corning 3160-152 To dissect/cut tissue
Insect Pins ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins Size 5 To pin tissue
Bench Pad VWR International 56617-014 Absorbent bench underpads
Rat surgical Kit Kent Scientific Corporation  INSRATKIT To remove and dissect tissue
2 Dumont #3 Forceps Kent Scientific Corporation  INS500064 To remove and dissect tissue
Tissue Forceps Kent Scientific Corporation  INS500092 To remove and dissect tissue
Scalpel Kent Scientific Corporation  INS500236 To remove and dissect tissue
Scalpel blade Kent Scientific Corporation  INS500239 To remove and dissect tissue
Professional Clipper  Braintree Scientific, Inc. CLP-223 45 To remove fur
Suture Thread Fine Science Tools 18020-50 Tie tissue
Tissue Clips Radnoti, LLC 158802 Attach tissue to rod/transducer
1 g weight  Mettler Toledo 11119525 For transducer calibration
Chemicals
Krebs Solution:
Sodium chloride
Potassium chloride
Monobasic potassium phosphate
Magnesium sulfate
Dextrose
Sodium bicarbonate
Calcium chloride
Magnesium chloride		  
Sigma
Fisher
Fisher
Fisher
Fisher
Sigma
EMD
Baker		  
S7653
P217-500
P285-3
M65-500
D16-500
S5761
CX0130-2
2444		 To prepare Krebs solution
Isoflurane Henry Schein 029405 To anesthetesize the animal
 Oxygen tank Matheson Tri Gas ox251 To use with anesthesia system
Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide)  Matheson Tri Gas Moxn00hn36D To aerate Krebs solutions

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References

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Medicina Número 90 Krebs las diferencias entre especies, La contractilidad del músculo liso estimulación neural
Vejiga contractilidad del músculo liso de Gaza como un método para evaluar tracto urinario inferior Farmacología
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Kullmann, F. A., Daugherty, S. L.,… More

Kullmann, F. A., Daugherty, S. L., de Groat, W. C., Birder, L. A. Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology. J. Vis. Exp. (90), e51807, doi:10.3791/51807 (2014).

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