التحقيق عالية الكثافة ميكروأرس البروتين وظيفية لكشف البروتين البروتين التفاعلات
Summary
باستخدام ميكروأرس البروتين تحتوي على ما يقرب من S. كامل تم بحثها الخباز بروتيوم للاستجواب غير متحيز السريع الآلاف من تفاعلات البروتين البروتين بشكل متواز. هذه الطريقة يمكن استخدامها ل-بروتين صغير جزيء أو تعديل posttranslational، وفحوصات أخرى في الإنتاجية العالية.
Abstract
يتم فحص عالية الكثافة ميكروأرس البروتين وظيفية تحتوي على ~ 4200 البروتينات الخميرة المؤتلف للتفاعل بروتين كيناز البروتين باستخدام الخميرة تقارب تنقية بروتين كيناز الانصهار التي تحتوي على علامة V5-حاتمة لقراءة إجراءات المغادرة. يتم الحصول على كيناز النقاء من خلال ثقافة سلالة الخميرة الأمثل للنسخة عالية إنتاج البروتين إيواء البلازميد التي تحتوي على الانصهار كيناز-V5 بناء تحت غال المروج محرض. ويزرع الخميرة في وسائل الإعلام تقييدا مع مصدر الكربون لمدة 6 ساعة تليها التعريفي مع 2٪ سكر اللبن. وبعد ذلك، يتم حصاد ثقافة ويتم تنقيته كيناز باستخدام تقنيات الكروماتوغرافي تقارب القياسية للحصول على بروتين كيناز العالية النقاء لاستخدامها في فحص. غير المخفف كيناز النقاء مع العازلة كيناز إلى مجموعة مناسبة للمقايسة ويتم حظر ميكروأرس البروتين قبل التهجين مع ميكروأري البروتين. بعد التهجين، وحققت في المصفوفات مع وحيدة النسيلة V5 antibODY لتحديد البروتينات ملزمة البروتين كيناز-V5. وأخيرا، يتم فحص صفائف باستخدام الماسح الضوئي ميكروأري القياسية، ويتم استخراج البيانات للتحليل المعلوماتية المصب 1،2 لتحديد ثقة عالية مجموعة من التفاعلات البروتينية للتحقق من صحة المصب في الجسم الحي.
Introduction
وقد أدت الحاجة إلى إجراء تحليلات عالمية الكيمياء الحيوية البروتين والنشاط في الجسم الحي ملزمة في تطوير أساليب جديدة لالتنميط البروتين البروتين التفاعلات (مثبطات مضخة البروتون) والتعديلات بعد متعدية من proteomes كلها 1،3-8. يتم تصنيع البروتين المجهرية كما المجهرية وظيفية البروتين باستخدام كامل طول البروتينات الوظيفية 4-6،8،9، أو ميكروأرس البروتين التحليلية التي تحتوي على أجسام مضادة 10،11. صممت انها تحتوي على كثافة عالية من البروتينات المحتشدة على الشرائح المجهر مع مجموعة متنوعة من كيمياء السطح لتسهيل مجموعة متنوعة من الظروف التجريبية اللازمة لإجراء واسعة النطاق البيوكيميائية تحليل 12. النيتروسليلوز وسطح ألدهيد كيمياء لمرفق الكيميائية من خلال يسين أو مرفق تقارب أساليب مثل الشرائح بالكلاب النيكل لربط البروتينات صاحب الموسومة والجلوتاثيون لمرفق تقارب بين الآخرين 13. </p>
استخدام ميكروأرس البروتين وظيفية للكشف عن البروتين البروتين التفاعلات يتطلب الوصول إلى ذات جودة عالية مكتبة بروتين وظيفي 14. S. الخباز غير قابلة للإنتاج مثل هذه المكتبة من خلال المزاوجة بين عالية نسخة تقارب الموسومة يبني البروتين مع الإنتاجية العالية تقنيات تنقية الكروماتوغرافي. وقد التسلسل الغالبية العظمى من الجينوم الخميرة ويمكن التعبير عن ما يقرب من بروتيوم كامل من البلازميد عالية نسخة لتنقية والكيمياء الحيوية ويحلل 12. مرة واحدة يتم الحصول على البروتينات والمحتشدة في شكل 384 بشكل جيد، يتم طباعتها على شريحة المجهر السماح للالموازي تحليل الكيمياء الحيوية متعددة حدودي السريع والاستجواب بيوينفورمتيك 8،14-16. وقد استخدمت المجهرية البروتين لفحوصات الأنزيمية وتفاعلات مع البروتينات، والدهون، والجزيئات الصغيرة، والأحماض النووية بين العديد من التطبيقات الأخرى. سهولة الحصول على البروتينات على سطح بروتيومصفائف جعلها قابلة للأنواع المختلفة من الكشف التحليلي بما في ذلك، المناعة تقارب، سطح مأكل مثل الطحين الرنين، مضان والعديد من التقنيات الأخرى. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح لمراقبة دقيقة للحالة تجريبية حيث أنه قد يكون من الصعب القيام به في الجسم الحي.
والهدف من هذا البروتوكول هو للتدليل على الاستخدام المناسب للميكروأرس البروتين وظيفية للكشف عن البروتين البروتين التفاعلات. هذا التطبيق يتيح تحليل الكيمياء الحيوية مواز عالية الإنتاجية من الأنشطة بروتين ملزمة باستخدام تحليلها عالي النقاء (البروتين) من الفائدة. الموسومة A-C محطة (كربوكسي المحطة الطرفية) تنتج V5 الانصهار بروتين الطعم من الاهتمام من البلازميد عالية نسخة في سلالة الخميرة الأمثل لتنقية البروتين. محطة C علامات يضمن أن بروتين كامل طول تمت ترجمة. البروتين المستخدم في هذه الدراسة هو Tda1-V5 انصهار بروتين كيناز، والتي يتم تنقيته باستخدام الراتنج النيكل تقارب عبر علامة His6X. وTda1-V5 الانصهار CONSTRUCيتم تنقيته من خلال ر شطف التسلسلي باستخدام التدرج إميدازول إلى أزل جزء الأكثر عالي التخصيب لاستخدامه في الفحص.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول المعروضة تم إجراء الأصل باستخدام 85 فريدة من نوعها بروتين الخميرة بروتينات كيناز-V5 الانصهار للمقارنة بين النشاط ملزم بين عائلات متميزة وذات الصلة تحركات البروتينات الخميرة مما أدى إلى التعرف على شبكات التفاعل كيناز جديدة في الجسم الحي 1. كتكنولوج…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the NIH. The assays shown in Figure 1 was performed by Dr. Joseph Fasolo. We thank Dr. Rui Chen for helpful comments.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Petri Dishes | VWR | NC-10747 | or comparable |
| Bacto yeast extract | Difco | 0217-17 | |
| Bacto peptone | Difco | 0118-17 | |
| Bacto agar | Difco | 0140-01 | |
| Dextrose | Sigma | D9434 | |
| Raffinose | Sigma | R0514 | |
| Galactose | Sigma | G0750 | |
| Sc-Ura drop out media | MP Bio | 114410622 | |
| Small Culture tubes | VWR/Fisher | ||
| Large Erlenmeyer Flask | VWR/Fisher | ||
| Centrifuge JA-10 rotor | |||
| Centrifuge tubes (500 mL) | |||
| Falcon tube (50 mL) | VWR/Fisher | 21008-951 | |
| PBS Tablets | Sigma | P4417 | |
| FastPrep Tubes(2ml screw cap tube) | |||
| FastPrep Machine | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Zircon Beads | BioSpec | 11079105 | |
| Triton X100 | Sigma | P4417 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| Imidazole (pH = 7.4) | Sigma | I5513 | |
| PMSF | Sigma | 93482 | |
| Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free) | Roche | 11873580001 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail 1 | sigma | P2850 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| ATP | Sigma | A1852 | |
| Shaking Incubator (30 °C) | |||
| Nickel Affinity Resin | Life Technologies | R901-01 | |
| G25 column | GE life sciences | 27-5325-01 | |
| Nutator | VWR/Fisher | ||
| SDS-PAGE Gel (NuPage) | Life Technologies | ||
| Coomassie Blue Stain | Life Technologies | ||
| Monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | R960-25 | |
| Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | 451098 | |
| Protein Microarrays Kit | Life Technologies | PAH0525013 | |
| Genepix Scanner | Molecular Devices | ||
| Lifter Slips | Thomas Scientific | http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/ | |
| Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) |
Add the reagents to 1 X PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution | ||
| Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20 | Add the reagents to 1 X PBS to obtain the desired volume of blocking buffer | ||
| Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl,500 μM ATP (for kinases), 1% BSA | Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2 | Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) | Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 – 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| 3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and 60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol) | galactose should not be autoclaved |
Referências
- Fasolo, J., et al. Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes. Genes. 25, 767-778 (2011).
- Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays. Genome biology. 7, R110 (2006).
- Breitkreutz, A., et al. A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast. Science. 328, 1043-1046 (2010).
- Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, 141-147 (2002).
- Jeong, J. S., et al. Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray. Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293, 2101-2105 (2001).
- Ptacek, J., et al. Global analysis of protein phosphorylation in yeast. Nature. 438, 679-684 (2005).
- Haab, B. B. Antibody arrays in cancer research. Molecular & cellular proteomics. Mol Cell Proteomics. 4 (4), 377-383 (2005).
- Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays–an emerging tool in cancer proteomics. The international journal of biochemistry & cell biology. 39, 1305-1317 (2007).
- Berrade, L., Garcia, A. E., Camarero, J. A. Protein microarrays: novel developments and applications. Pharmaceutical research. 28, 1480-1499 (2011).
- Balboni, I., Limb, C., Tenenbaum, J. D., Utz, P. J. Evaluation of microarray surfaces and arraying parameters for autoantibody profiling. Proteomics. 8, 3443-3449 (2008).
- Gelperin, D. M., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes & development. 19, 2816-2826 (2005).
- Fasolo, J., Snyder, M. Protein microarrays. Methods Mol. Biol. 548, 209-222 (2009).
- Im, H., Snyder, M., Coligan, J. E., et al. Preparation of recombinant protein spotted arrays for proteome-wide identification of kinase targets. Current protocols in protein science. 27, Unit 27 24 (2013).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
