고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이를 프로빙하는 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기
Summary
거의 전체 (S)를 포함하는 단백질 마이크로 어레이를 사용하여 cerevisiae의 프로테옴은 병렬 단백질 – 단백질 상호 작용의 수천의 신속한 편견 심문 프로브된다. 이 방법은 단백질 – 소분자, 번역 후 수정 및 높은 처리량의 다른 분석을 위해 이용 될 수있다.
Abstract
~ 4,200 재조합 효모 단백질을 함유하는 고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이는 판독에 대한 V5 에피토프 태그를 함유하는 친 화성 정제 효모 키나제 융합 단백질을 사용하여 키나아제 단백질 – 단백질 상호 작용을 조사한다. 정제 키나제 키나제 V5 융합체는 GAL 유도 성 프로모터 하에서 구축 플라스미드를 함유하는 형질 높은 사본 단백질 생산을 위해 최적화 효모 균주의 배양을 통해 얻어진다. 효모는 2 %의 갈락토오스와 유도 한 다음 6 시간 동안 중립 탄소원과 제한 배지에서 성장시킨다. 그 다음, 배양 물 수거되고 키나제 분석에 사용하기위한 고순도의 단백질 키나아제를 얻었다 표준 친화 크로마토 그래피 기술을 사용하여 정제한다. 정제 키나아제 분석을 위해 적절한 범위로 키나아제 완충액으로 희석하고 단백질 마이크로 어레이는 종래 단백질 마이크로 어레이와 하이브리드 화를 차단한다. 혼성화 후, 어레이는 단클론 V5의 antib로게나ODY은 키나제-V5 단백질에 의해 결합 단백질을 식별합니다. 마지막으로, 어레이는 표준 마이크로 어레이 스캐너를 사용하여 스캔되고, 데이터는 생체 내에서 검증을 위해 하류 단백질 상호 작용의 세트 높은 신뢰도를 결정하기 위해 하류 정보학 분석 1,2- 위해 추출된다.
Introduction
단백질 생화학 및 생체 내에서 결합 활성의 글로벌 분석을 수행 할 필요가 단백질 – 단백질 상호 작용 (프로톤 펌프 억제제) 및 전체 프로테옴 1,3-8의 번역 후 변형 프로파일에 대한 새로운 방법의 발전을 가져왔다. 단백질 마이크로 어레이는 항체 (10, 11)를 포함하는 4-6,8,9 전체 길이 기능성 단백질을 사용하여 기능성 단백질 마이크로 어레이, 또는 분석 단백질 마이크로 어레이로 제조된다. 이들은 12 광범위한 분석을 생화학 실험 실시에 필요한 다양한 조건을 용이하게하기 위해, 표면의 화학 다양한 현미경 슬라이드 상에 배열 된 단백질의 고밀도를 포함하도록 설계된다. 같은 다른 사람 (13) 사이의 친 화성이 부착 그의 – 태그 단백질과 글루타티온를 연결하는 니켈 킬레이트 슬라이드로 라이신 또는 선호도 부착 방법을 통해 화학 부착 니트로 셀룰로오스와 알데히드 표면 화학. </p>
단백질 – 단백질 상호 작용을 검출하는 기능성 단백질 마이크로 어레이를 사용하면 고품질의 기능성 단백질 라이브러리 (14)에 대한 액세스를 필요로한다. S.을 cerevisiae의 높은 처리량 크로마토 그래피 정제 기술과 단백질 구조를 태그 높은 복사 친 화성의 페어링을 통해 이러한 라이브러리를 생산하는 의무가있다. 효모 게놈의 대부분은 서열화되어 거의 전체 프로테옴 정화용 높은 카피 플라스미드로부터 발현 될 수 있으며, 생화학 (12)를 분석한다. 단백질을 수득 및 384- 웰 포맷으로 배열되면, 이들은 빠른 병렬 다중 파라 생화학 및 생물 정보학적인 분석을 가능하게 심문 8,14-16 현미경 슬라이드 상에 인쇄된다. 단백질 마이크로 어레이는 다른 많은 응용들 중 단백질, 지질, 소분자, 핵산과 효소 분석법과의 상호 작용을 위해 사용되어왔다. 프로테옴의 표면에 단백질의 접근성배열은 다음과 같은 분석 검출 다른 유형의 면역 친 화성에 그들이 순종 할 플라즈몬 공명, 형광 및 다른 많은 기술을 표면. 또한,이 생체 내에서 수행하기 어려울 수있는 실험 조건의 미세 조정을 허용한다.
이 프로토콜의 목적은 단백질 – 단백질 상호 작용을 검출하는 기능성 단백질 마이크로 어레이의 적절한 사용을 설명한다. 이 애플리케이션은 관심 고순도 검체 (단백질)를 사용하여 단백질 결합 활동 높은 처리량 병렬 생화학 분석을 가능하게한다. C 말단 (말단 카복시) 관심 V5 미끼 융합 단백질 단백질 정제를 위해 최적화 된 효모 균주에서 높은 카피 플라스미드로부터 생성되는 태그. C 말단 태깅 전장 단백질 번역 한 것을 보장한다. 본 연구에 사용 된 단백질은 His6X 태그를 통해 니켈 친 화성 수지를 사용하여 정제한다 Tda1-V5 융합 단백질 키나아제이다. Tda1-V5 융합 CONSTRUCt는 분석법에 사용하기에 가장 고농축 분획을 용리 이미 다졸 구배를 사용하여 용출을 통해 직렬 정제한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜은 원래 생체 한 새로운 키나제 상호 작용 네트워크의 식별 결과 효모 단백질 키나제의 구별과 관련 제품군 간의 결합 활성을 비교하는 (85) 고유의 효모 단백질 키나제 V5 융합 단백질을 사용하여 수행 하였다 선보였다. 신흥 프로테옴 프로파일 링 기술로, 높은 처리량 (HTP) 펩타이드 라이브러리, 진핵 생물과 원핵 생물의 모델 생물 8,17에 의존 단백질 마이크?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the NIH. The assays shown in Figure 1 was performed by Dr. Joseph Fasolo. We thank Dr. Rui Chen for helpful comments.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Petri Dishes | VWR | NC-10747 | or comparable |
| Bacto yeast extract | Difco | 0217-17 | |
| Bacto peptone | Difco | 0118-17 | |
| Bacto agar | Difco | 0140-01 | |
| Dextrose | Sigma | D9434 | |
| Raffinose | Sigma | R0514 | |
| Galactose | Sigma | G0750 | |
| Sc-Ura drop out media | MP Bio | 114410622 | |
| Small Culture tubes | VWR/Fisher | ||
| Large Erlenmeyer Flask | VWR/Fisher | ||
| Centrifuge JA-10 rotor | |||
| Centrifuge tubes (500 mL) | |||
| Falcon tube (50 mL) | VWR/Fisher | 21008-951 | |
| PBS Tablets | Sigma | P4417 | |
| FastPrep Tubes(2ml screw cap tube) | |||
| FastPrep Machine | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Zircon Beads | BioSpec | 11079105 | |
| Triton X100 | Sigma | P4417 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| Imidazole (pH = 7.4) | Sigma | I5513 | |
| PMSF | Sigma | 93482 | |
| Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free) | Roche | 11873580001 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail 1 | sigma | P2850 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| ATP | Sigma | A1852 | |
| Shaking Incubator (30 °C) | |||
| Nickel Affinity Resin | Life Technologies | R901-01 | |
| G25 column | GE life sciences | 27-5325-01 | |
| Nutator | VWR/Fisher | ||
| SDS-PAGE Gel (NuPage) | Life Technologies | ||
| Coomassie Blue Stain | Life Technologies | ||
| Monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | R960-25 | |
| Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | 451098 | |
| Protein Microarrays Kit | Life Technologies | PAH0525013 | |
| Genepix Scanner | Molecular Devices | ||
| Lifter Slips | Thomas Scientific | http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/ | |
| Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) |
Add the reagents to 1 X PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution | ||
| Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20 | Add the reagents to 1 X PBS to obtain the desired volume of blocking buffer | ||
| Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl,500 μM ATP (for kinases), 1% BSA | Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2 | Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) | Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 – 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| 3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and 60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol) | galactose should not be autoclaved |
Referências
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