חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות
Summary
באמצעות מערכי חלבון המכיל כמעט את כל ס proteome cerevisiae הוא חקר לחקירה משוחדת מהירה של אלפי אינטראקציות חלבון-חלבון במקביל. שיטה זו יכולה להיות מנוצלת למולקולת חלבון קטן, שינוי posttranslational, ומבחנים אחרים בתפוקה גבוהה.
Abstract
microarrays חלבון הפונקציונלי בצפיפות גבוהה המכיל ~ 4,200 חלבוני שמרי רקומביננטי נבחנים לאינטראקציות חלבון-חלבון קינאז באמצעות חלבון היתוך הזיקה מטוהרת השמרים קינאז המכיל תג V5-epitope לקריאה החוצה. קינאז המטוהר מתקבל באמצעות התרבות של זן שמרים מותאמים לייצור חלבון גבוה עותק מחסה פלסמיד המכיל היתוך קינאז-V5 לבנות תחת אמרגן מושרה GAL. השמרים הוא גדלו בתקשורת כובל עם מקור פחמן ניטראלי עבור 6 שעות אחרי אינדוקציה עם גלקטוז 2%. בשלב הבא, התרבות שנקטפו וקינאז הוא מטוהר באמצעות טכניקות chromatographic זיקה סטנדרטית להשיג קינאז חלבון נקי במיוחד לשימוש בassay. קינאז המטוהר מדולל עם חיץ קינאז לטווח מתאים עבור assay וmicroarrays החלבון חסום לפני הכלאה עם microarray החלבון. לאחר ההכלאה, המערכים מששו עם antib V5 חד שבטיody לזהות חלבונים מחויבים לחלבון קינאז-V5. לבסוף, המערכים נסרקים באמצעות סורק microarray סטנדרטי, והנתונים מופק לניתוח אינפורמטיקה במורד הזרם 1,2 לקבוע אמון גבוה שנקבע של אינטראקציות חלבון לאימות במורד הזרם in vivo.
Introduction
הצורך לבצע ניתוחים הגלובליים של ביוכימיה של חלבונים ומחייבים פעילות בvivo הביא לפיתוח שיטות החדשות לאפיון אינטראקציות בין חלבונים (PPIs) ולאחר translational השינויים של proteomes כל 1,3-8. microarrays חלבון מיוצרים כmicroarrays פונקציונלי חלבון באמצעות חלבונים פונקציונליים באורך מלא 4-6,8,9, או microarrays חלבון אנליטיים המכיל נוגדני 10,11. הם מתוכננים להכיל בצפיפות גבוהה של חלבונים ערוכים על גבי שקופיות מיקרוסקופ עם מגוון רחב של chemistries משטח כדי להקל על מגוון של תנאי ניסוי הנדרשים לביצוע ביוכימיים רחבים מנתחת 12. chemistries Nitrocellulose ומשטח אלדהיד לקובץ מצורף כימי באמצעות שיטות ליזין או קובץ מצורף זיקה כגון מגלשות chelated ניקל לחיבור חלבונים וגלוטתיון מתויג לקובץ מצורף זיקה בין יתר 13. </p>
השימוש בmicroarrays חלבון הפונקציונלי כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון דורש גישה לספריית חלבון פונקציונלי באיכות גבוהה 14. ס cerevisiae ניתנים להפקת ספרייה כגון דרך הזיווג של גבוה עותק זיקה מתויג מבני חלבון עם טכניקות טיהור chromatographic תפוקה גבוהה. הרוב המכריע של שמרי הגנום כבר רצף וכמעט כל proteome יכולה לבוא לידי ביטוי מגבוה עותק פלסמיד לטיהור וביוכימיים מנתחים 12. ברגע שהחלבונים מתקבלים וערוכים בפורמט 384 גם, הם מודפסים על גבי שקופית מיקרוסקופ המאפשרת ניתוח מהיר מקביל רב פרמטרית ביוכימיים וחקירה bioinformatic 8,14-16. microarrays החלבון שימש עבור מבחני האנזימטית ואינטראקציות עם חלבונים, שומנים, מולקולות קטנות, וחומצות גרעין בין יישומים רבים אחרים. הנגישות של חלבונים על פני השטח של proteomeמערכים להפוך אותם נוחים לסוגים שונים של זיהוי אנליטיים כוללים, חיסון-זיקה, משטח Plasmon תהודה, הקרינה ורבים טכניקות אחרות. יתר על כן, היא מאפשרת לבקרה טובה של תנאי הניסוי שבו זה יכול להיות קשה לעשות in vivo.
המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים את השימוש המתאים של microarrays חלבון הפונקציונלי כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון. יישום זה מאפשר הניתוח ביוכימי המקביל תפוקה גבוהה של פעילות חלבון מחייב שימוש אנליטי נקי במיוחד (חלבון) של עניין. C-מסוף (carboxy מסוף) מתויג חלבון פיתיון V5-היתוך של העניין מופק מפלסמיד גבוה עותק בזן שמרים מותאמים לטיהור חלבונים. תיוג C-המסוף מבטיח כי החלבון באורך מלא תורגם. החלבון השתמש במחקר זה הוא קינאז חלבון היתוך Tda1-V5, אשר מטוהר באמצעות שרף זיקת ניקל באמצעות תג His6X. CONSTRUC היתוך Tda1-V5לא מטוהר באמצעות elution הסידורי באמצעות שיפוע imidazole לelute שבריר ביותר המועשר לשימוש בassay.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול שהוצג במקור מבוצע באמצעות 85 חלבוני היתוך קינאז-V5 שמרי חלבון ייחודיים כדי להשוות פעילות מחייבת בין משפחות שונות וקשורות של קינאזות שמרי חלבון וכתוצאה מכך ההזדהות של רשתות האינטראקציה קינאז החדשות in vivo 1. כטכנולוגית פרופיל proteomic מתעוררים, הפיתוח ש…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the NIH. The assays shown in Figure 1 was performed by Dr. Joseph Fasolo. We thank Dr. Rui Chen for helpful comments.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Petri Dishes | VWR | NC-10747 | or comparable |
| Bacto yeast extract | Difco | 0217-17 | |
| Bacto peptone | Difco | 0118-17 | |
| Bacto agar | Difco | 0140-01 | |
| Dextrose | Sigma | D9434 | |
| Raffinose | Sigma | R0514 | |
| Galactose | Sigma | G0750 | |
| Sc-Ura drop out media | MP Bio | 114410622 | |
| Small Culture tubes | VWR/Fisher | ||
| Large Erlenmeyer Flask | VWR/Fisher | ||
| Centrifuge JA-10 rotor | |||
| Centrifuge tubes (500 mL) | |||
| Falcon tube (50 mL) | VWR/Fisher | 21008-951 | |
| PBS Tablets | Sigma | P4417 | |
| FastPrep Tubes(2ml screw cap tube) | |||
| FastPrep Machine | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Zircon Beads | BioSpec | 11079105 | |
| Triton X100 | Sigma | P4417 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| Imidazole (pH = 7.4) | Sigma | I5513 | |
| PMSF | Sigma | 93482 | |
| Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free) | Roche | 11873580001 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail 1 | sigma | P2850 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| ATP | Sigma | A1852 | |
| Shaking Incubator (30 °C) | |||
| Nickel Affinity Resin | Life Technologies | R901-01 | |
| G25 column | GE life sciences | 27-5325-01 | |
| Nutator | VWR/Fisher | ||
| SDS-PAGE Gel (NuPage) | Life Technologies | ||
| Coomassie Blue Stain | Life Technologies | ||
| Monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | R960-25 | |
| Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | 451098 | |
| Protein Microarrays Kit | Life Technologies | PAH0525013 | |
| Genepix Scanner | Molecular Devices | ||
| Lifter Slips | Thomas Scientific | http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/ | |
| Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) |
Add the reagents to 1 X PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution | ||
| Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20 | Add the reagents to 1 X PBS to obtain the desired volume of blocking buffer | ||
| Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl,500 μM ATP (for kinases), 1% BSA | Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2 | Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) | Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 – 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| 3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and 60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol) | galactose should not be autoclaved |
Referências
- Fasolo, J., et al. Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes. Genes. 25, 767-778 (2011).
- Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays. Genome biology. 7, R110 (2006).
- Breitkreutz, A., et al. A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast. Science. 328, 1043-1046 (2010).
- Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, 141-147 (2002).
- Jeong, J. S., et al. Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray. Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293, 2101-2105 (2001).
- Ptacek, J., et al. Global analysis of protein phosphorylation in yeast. Nature. 438, 679-684 (2005).
- Haab, B. B. Antibody arrays in cancer research. Molecular & cellular proteomics. Mol Cell Proteomics. 4 (4), 377-383 (2005).
- Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays–an emerging tool in cancer proteomics. The international journal of biochemistry & cell biology. 39, 1305-1317 (2007).
- Berrade, L., Garcia, A. E., Camarero, J. A. Protein microarrays: novel developments and applications. Pharmaceutical research. 28, 1480-1499 (2011).
- Balboni, I., Limb, C., Tenenbaum, J. D., Utz, P. J. Evaluation of microarray surfaces and arraying parameters for autoantibody profiling. Proteomics. 8, 3443-3449 (2008).
- Gelperin, D. M., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes & development. 19, 2816-2826 (2005).
- Fasolo, J., Snyder, M. Protein microarrays. Methods Mol. Biol. 548, 209-222 (2009).
- Im, H., Snyder, M., Coligan, J. E., et al. Preparation of recombinant protein spotted arrays for proteome-wide identification of kinase targets. Current protocols in protein science. 27, Unit 27 24 (2013).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
