Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama
Summary
Neredeyse tüm S. içeren protein mikrodiziler kullanarak cerevisiae proteom paralel protein-protein etkileşimleri, binlerce hızlı tarafsız sorgulama için incelenir. Bu yöntem, protein-küçük molekül, translasyon sonrası modifikasyon ve yüksek verimlilik Diğer tahliller için kullanılabilecektir.
Abstract
~ 4200 rekombinant maya proteinleri içeren yüksek yoğunluklu fonksiyonel bir protein mikrodizileri okuması için V5-epitop etiketi ihtiva eden bir afinite saflaştınldı maya kinaz füzyon proteini kullanılarak kinaz, protein-protein etkileşimleri için incelenir. Saflaştırılmış kinaz bir kinaz-V5 füzyon GAL uyarımlı promotör altında yapıyı içeren bir plazmid yüksek kopya protein üretimi için optimize edilmiş bir maya suşu kültürü ile elde edilir. maya,% 2 galaktoz ile endüksiyon ile, ardından 6 saat boyunca nötr bir karbon kaynağı ile kısıtlayıcı ortamda yetiştirilir. Daha sonra, kültür hasat edilir ve kinaz deneyinde kullanılmak için yüksek ölçüde saflaştırılmış protein kinaz elde etmek üzere standart afinite kromatografik teknikleri kullanılarak saflaştırılır. Saflaştırılmış kinaz deneyi için uygun bir aralığı, kinaz tamponu ile seyreltilir ve protein mikro-dizileri, protein önce mikroarray ile hibridizasyon için bloke edilir. Hibritlemeden sonra, diziler monoklonal V5 antib ile sondalandıODY kinaz-V5 proteiniyle bağlanmış proteinleri belirlemek için. Son olarak, diziler, standart bir mikrodizi tarayıcısı kullanılarak tarandı ve veriler, in vivo aşağı doğru doğrulama için protein etkileşimleri belirlenen yüksek bir güven belirlemek için alt bilişim analiz 1,2 ekstre edilir.
Introduction
Protein biyokimya ve in vivo bağlanma faaliyeti küresel analizlerini gerçekleştirmek için gerek protein-protein etkileşimlerini (PPIs) ve bütün proteomlarda 1,3-8 arasında post-translasyonel modifikasyonlar profil için yeni yöntemlerin geliştirilmesine yol açmıştır. Protein mikrodizileri antikorları 10,11 ihtiva 4-6,8,9 tam uzunlukta fonksiyonel proteinleri kullanılarak fonksiyonel bir protein mikrodizilerinin veya analitik protein mikrodizilerinin olarak imal edilir. Bunlar 12 analiz, geniş kapsamlı biyokimyasal iletmek için gereken deney koşulları çeşitli kolaylaştırmak için yüzey kimyaları çeşitli mikroskop lamları üzerine dizilmiş, proteinlerin yüksek yoğunluklu içeren tasarlanmıştır. Bu tür diğerleri 13 arasında afinite eki için His-etiketli proteinler ve glutatyon takmak için nikel şelatlı slaytlar olarak lizin veya afinite eki yöntemleri ile kimyasal bağlanması için nitroselüloz ve aldehit yüzey kimyaları. </p>
protein-protein etkileşimleri tespit etmek için fonksiyonel protein mikrodizilerinin kullanımı yüksek kaliteli, fonksiyonel bir protein kitaplığına 14 erişim gerektirir. S. cerevisiae yüksek verimli kromatografik saflaştırma teknikleri protein takılı yapılar yüksek kopya afinitesi eşleştirme yoluyla bu tür bir kütüphane üretilmesi için müsait olan. Maya genomunun büyük bir çoğunluğu dizilenmiştir ve neredeyse tüm proteom saflaştırma için yüksek kopya plazmid eksprese edilebilir ve biyokimyasal 12 analiz eder. Proteinler elde edilir ve 384 oyuklu formatta dizilmiş sonra, bunlar, hızlı paralel çok parametre biyokimyasal analizler ve biyoinformatik sorgulama 8,14-16 sağlayan bir mikroskop lamı üzerine basılır. Protein mikrodizileri diğer birçok uygulamalar arasında proteinler, lipidler, küçük moleküller, ve nükleik asitler ile enzimatik deney ve etkileşimleri için kullanılmıştır. proteomun yüzeyi üzerinde proteinlerin erişilebilirlikdiziler de dahil olmak üzere, analitik tespiti farklı immün afinite onları müsait hale plazmon rezonansı, floresans ve pek çok başka teknik yüzeyler. Ayrıca, in vivo yapmak zor olabilir deneysel koşul ince kontrol sağlar.
Bu protokolün amacı, protein-protein etkileşimleri tespit etmek için fonksiyonel protein mikrodizilerinin uygun kullanımını göstermektir. Bu uygulama, ilgi konusu bir yüksek ölçüde saflaştırılmış analiti (protein) kullanılarak protein bağlanma faaliyetleri, yüksek verimli, paralel biyokimyasal analiz sağlar. Bir C-terminali (ucu karboksi) ilgi V5-füzyon yem proteini, protein saflaştırma için optimize edilmiş bir maya suşunda bir yüksek kopya plazmid elde edilir etiketli. C-terminali etiketleme tam boyda bir protein çevrildi sağlar. Bu çalışmada kullanılan protein His6X etiketi ile nikel afinite reçinesi kullanılarak saflaştırılır Tda1-V5 füzyon protein kinaz vardır. Tda1-V5 füzyon konstrüksiyont tahlilinde kullanım için en fazla zenginleştirilmiş fraksiyonu elüt edilmesi için bir imidazol gradyanı kullanılarak, seri elüsyon yoluyla saflaştırılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol başlangıçta in vivo 1'de yeni kinaz etkileşim ağlarının tanımlanmasında elde edilen maya protein kinazların farklı ve ilgili ailelerdeki bağlanma aktivitesini karşılaştırmak için 85 benzersiz bir maya protein kinaz-V5 füzyon proteinleri kullanılarak gerçekleştirildi kullanarak verilmiştir. Gelişmekte olan bir proteomik profilleme teknolojisi olarak, Yüksek Çıkan (SDP) peptid kütüphaneleri ve ökaryotik ve prokaryotik model organizmaların 8,17 dayan…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the NIH. The assays shown in Figure 1 was performed by Dr. Joseph Fasolo. We thank Dr. Rui Chen for helpful comments.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Petri Dishes | VWR | NC-10747 | or comparable |
| Bacto yeast extract | Difco | 0217-17 | |
| Bacto peptone | Difco | 0118-17 | |
| Bacto agar | Difco | 0140-01 | |
| Dextrose | Sigma | D9434 | |
| Raffinose | Sigma | R0514 | |
| Galactose | Sigma | G0750 | |
| Sc-Ura drop out media | MP Bio | 114410622 | |
| Small Culture tubes | VWR/Fisher | ||
| Large Erlenmeyer Flask | VWR/Fisher | ||
| Centrifuge JA-10 rotor | |||
| Centrifuge tubes (500 mL) | |||
| Falcon tube (50 mL) | VWR/Fisher | 21008-951 | |
| PBS Tablets | Sigma | P4417 | |
| FastPrep Tubes(2ml screw cap tube) | |||
| FastPrep Machine | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Zircon Beads | BioSpec | 11079105 | |
| Triton X100 | Sigma | P4417 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| Imidazole (pH = 7.4) | Sigma | I5513 | |
| PMSF | Sigma | 93482 | |
| Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free) | Roche | 11873580001 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail 1 | sigma | P2850 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| ATP | Sigma | A1852 | |
| Shaking Incubator (30 °C) | |||
| Nickel Affinity Resin | Life Technologies | R901-01 | |
| G25 column | GE life sciences | 27-5325-01 | |
| Nutator | VWR/Fisher | ||
| SDS-PAGE Gel (NuPage) | Life Technologies | ||
| Coomassie Blue Stain | Life Technologies | ||
| Monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | R960-25 | |
| Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | 451098 | |
| Protein Microarrays Kit | Life Technologies | PAH0525013 | |
| Genepix Scanner | Molecular Devices | ||
| Lifter Slips | Thomas Scientific | http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/ | |
| Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) |
Add the reagents to 1 X PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution | ||
| Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20 | Add the reagents to 1 X PBS to obtain the desired volume of blocking buffer | ||
| Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl,500 μM ATP (for kinases), 1% BSA | Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2 | Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) | Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 – 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| 3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and 60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol) | galactose should not be autoclaved |
Referências
- Fasolo, J., et al. Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes. Genes. 25, 767-778 (2011).
- Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays. Genome biology. 7, R110 (2006).
- Breitkreutz, A., et al. A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast. Science. 328, 1043-1046 (2010).
- Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, 141-147 (2002).
- Jeong, J. S., et al. Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray. Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293, 2101-2105 (2001).
- Ptacek, J., et al. Global analysis of protein phosphorylation in yeast. Nature. 438, 679-684 (2005).
- Haab, B. B. Antibody arrays in cancer research. Molecular & cellular proteomics. Mol Cell Proteomics. 4 (4), 377-383 (2005).
- Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays–an emerging tool in cancer proteomics. The international journal of biochemistry & cell biology. 39, 1305-1317 (2007).
- Berrade, L., Garcia, A. E., Camarero, J. A. Protein microarrays: novel developments and applications. Pharmaceutical research. 28, 1480-1499 (2011).
- Balboni, I., Limb, C., Tenenbaum, J. D., Utz, P. J. Evaluation of microarray surfaces and arraying parameters for autoantibody profiling. Proteomics. 8, 3443-3449 (2008).
- Gelperin, D. M., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes & development. 19, 2816-2826 (2005).
- Fasolo, J., Snyder, M. Protein microarrays. Methods Mol. Biol. 548, 209-222 (2009).
- Im, H., Snyder, M., Coligan, J. E., et al. Preparation of recombinant protein spotted arrays for proteome-wide identification of kinase targets. Current protocols in protein science. 27, Unit 27 24 (2013).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
