Probing hoge dichtheid functioneel eiwit Microarrays om eiwit-eiwit interacties Detect
Summary
Met behulp van eiwit microarrays met bijna het hele S. cerevisiae proteoom wordt gesondeerd voor snelle onpartijdige ondervraging van duizenden proteïne-proteïne interacties in parallel. Deze werkwijze kan worden gebruikt voor eiwit-kleine molecule, posttranslationele modificatie, en andere assays high-throughput.
Abstract
High-density functioneel eiwit microarrays die ~ 4200 recombinante gist-eiwitten onderzocht-eiwit-eiwit-interacties via affiniteit gezuiverd gist-kinase-fusie-eiwit dat een V5-epitoop tag voor uitlezing. Gezuiverde kinase wordt verkregen door kweken van een giststam geoptimaliseerd voor hoog kopie eiwitproductie herbergt een plasmide dat een kinase-V5 fusieconstruct onder een induceerbare GAL-promoter. De gist wordt gekweekt bij restrictieve media met een neutrale koolstofbron gedurende 6 uur gevolgd door inductie met 2% galactose. Vervolgens wordt de kweek geoogst en kinase onder toepassing van standaard affiniteit chromatografische technieken om een zeer zuivere eiwit kinase voor toepassing bij de assay te verkrijgen gezuiverd. Het gezuiverde kinase wordt verdund met kinase buffer een geschikt bereik voor de analyse en het eiwit microarrays worden geblokkeerd voordat hybridisatie met de eiwit microarray. Na de hybridisatie worden de arrays gesondeerd met monoklonale V5 ANTIBody aan eiwitten door de kinase-V5 eiwitgebonden identificeren. Tenslotte worden de arrays gescand met een standaard microarray scanner en gegevens geëxtraheerd downstream informatische analyse 1,2 tot een groot vertrouwen reeks eiwitinteracties voor downstream validatie in vivo te bepalen.
Introduction
De noodzaak om globale analyse van eiwitbiochemie bindingsactiviteit en in vivo uitvoeren heeft geleid tot de ontwikkeling van nieuwe methodes voor het profileren van eiwit-eiwitinteracties (PPI) en de post-translationele modificaties van hele proteomen 1,3-8. Proteïne microarrays worden vervaardigd als functioneel eiwit microarrays met behulp van full-length functionele eiwitten 4-6,8,9 of analytische eiwit microarrays die antilichamen bevatten 10,11. Ze zijn ontworpen om een hoge dichtheid van eiwitten gerangschikt op microscoopglaasjes met verschillende oppervlakchemie bevatten een verscheidenheid van de verrichting van een brede biochemische analyses 12 proefomstandigheden vergemakkelijken. Nitrocellulose en aldehyde oppervlakchemie voor chemische bevestiging door middel van lysine of affiniteit gehechtheid methoden zoals nikkel gechelateerde slides voor het bevestigen van His-gemerkte eiwitten en glutathion voor affiniteit bevestiging onder anderen 13. </p>
Het gebruik van functioneel eiwit microarrays eiwit-eiwit interacties te detecteren is toegang tot een hoogwaardig functioneel eiwitbibliotheek 14. S. cerevisiae vatbaar is voor productie van een dergelijk bibliotheek door de koppeling van high-copy affiniteit gelabeld eiwit constructen met high-throughput chromatografische zuiveringstechnieken. Het overgrote deel van de gist genoom is gesequenced en vrijwel de gehele proteoom kan worden uitgedrukt door een hoog-kopie plasmide voor zuivering en biochemische analyses 12. Zodra de eiwitten worden verkregen en gekleed in 384-well formaat, worden ze afgedrukt op een microscoopglaasje waardoor een snelle parallelle multi-parametrische biochemische analyse en bioinformatica ondervraging 8,14-16. Proteïne microarrays zijn gebruikt voor enzymatische assays en interacties met eiwitten, lipiden, kleine moleculen, en nucleïnezuren onder vele andere toepassingen. De toegankelijkheid van eiwitten op het oppervlak van proteoomarrays maken ze vatbaar voor verschillende analytische detectie waaronder immuun-affiniteit, Surface Plasmon Resonance, fluorescentie en vele andere technieken. Bovendien maakt een nauwkeurige controle van de experimentele conditie waar het moeilijk in vivo kunnen zijn.
Het doel van dit protocol is het juiste gebruik van functioneel eiwit microarrays eiwit-eiwit interacties te detecteren tonen. Deze applicatie maakt het mogelijk high-throughput parallel biochemische analyse van eiwit binding activiteiten met een sterk gezuiverde analyt (eiwit) van belang. Een C-eindstandig (carboxy-terminale) gelabeld V5-fusie-bait eiwit van belang wordt geproduceerd uit een hoog-kopie plasmide in een giststam geoptimaliseerd voor eiwitzuivering. C-terminale tagging zodat de volledige lengte eiwit is vertaald. Het eiwit gebruikt in deze studie is Tda1-V5 fusieproteïne kinase dat gezuiverd wordt met behulp van nikkel affiniteitshars via een His6X tag. De Tda1-V5 fusion construct gebruikt een imidazoolgradiënt de meest verrijkte fractie voor toepassing bij de assay elueren via seriële elutie gezuiverd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gepresenteerde protocol werd oorspronkelijk uitgevoerd onder toepassing van 85 unieke gist proteïne kinase-V5 fusie-eiwitten aan bindingsactiviteit tussen afzonderlijke en verwante families gist eiwitkinasen resulteert in de identificatie van nieuwe kinase interactienetwerken in vivo 1 Vergelijk. Als een opkomende proteomics profiling technologie, de ontwikkeling van High Throughput (HTP) screening van proteomen gebruik van proteïne microarrays zich op peptide bibliotheken en eukaryotische en p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the NIH. The assays shown in Figure 1 was performed by Dr. Joseph Fasolo. We thank Dr. Rui Chen for helpful comments.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Petri Dishes | VWR | NC-10747 | or comparable |
| Bacto yeast extract | Difco | 0217-17 | |
| Bacto peptone | Difco | 0118-17 | |
| Bacto agar | Difco | 0140-01 | |
| Dextrose | Sigma | D9434 | |
| Raffinose | Sigma | R0514 | |
| Galactose | Sigma | G0750 | |
| Sc-Ura drop out media | MP Bio | 114410622 | |
| Small Culture tubes | VWR/Fisher | ||
| Large Erlenmeyer Flask | VWR/Fisher | ||
| Centrifuge JA-10 rotor | |||
| Centrifuge tubes (500 mL) | |||
| Falcon tube (50 mL) | VWR/Fisher | 21008-951 | |
| PBS Tablets | Sigma | P4417 | |
| FastPrep Tubes(2ml screw cap tube) | |||
| FastPrep Machine | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Zircon Beads | BioSpec | 11079105 | |
| Triton X100 | Sigma | P4417 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| Imidazole (pH = 7.4) | Sigma | I5513 | |
| PMSF | Sigma | 93482 | |
| Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free) | Roche | 11873580001 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail 1 | sigma | P2850 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| ATP | Sigma | A1852 | |
| Shaking Incubator (30 °C) | |||
| Nickel Affinity Resin | Life Technologies | R901-01 | |
| G25 column | GE life sciences | 27-5325-01 | |
| Nutator | VWR/Fisher | ||
| SDS-PAGE Gel (NuPage) | Life Technologies | ||
| Coomassie Blue Stain | Life Technologies | ||
| Monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | R960-25 | |
| Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | 451098 | |
| Protein Microarrays Kit | Life Technologies | PAH0525013 | |
| Genepix Scanner | Molecular Devices | ||
| Lifter Slips | Thomas Scientific | http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/ | |
| Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) |
Add the reagents to 1 X PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution | ||
| Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20 | Add the reagents to 1 X PBS to obtain the desired volume of blocking buffer | ||
| Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl,500 μM ATP (for kinases), 1% BSA | Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2 | Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) | Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 – 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| 3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and 60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol) | galactose should not be autoclaved |
Referências
- Fasolo, J., et al. Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes. Genes. 25, 767-778 (2011).
- Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays. Genome biology. 7, R110 (2006).
- Breitkreutz, A., et al. A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast. Science. 328, 1043-1046 (2010).
- Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, 141-147 (2002).
- Jeong, J. S., et al. Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray. Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293, 2101-2105 (2001).
- Ptacek, J., et al. Global analysis of protein phosphorylation in yeast. Nature. 438, 679-684 (2005).
- Haab, B. B. Antibody arrays in cancer research. Molecular & cellular proteomics. Mol Cell Proteomics. 4 (4), 377-383 (2005).
- Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays–an emerging tool in cancer proteomics. The international journal of biochemistry & cell biology. 39, 1305-1317 (2007).
- Berrade, L., Garcia, A. E., Camarero, J. A. Protein microarrays: novel developments and applications. Pharmaceutical research. 28, 1480-1499 (2011).
- Balboni, I., Limb, C., Tenenbaum, J. D., Utz, P. J. Evaluation of microarray surfaces and arraying parameters for autoantibody profiling. Proteomics. 8, 3443-3449 (2008).
- Gelperin, D. M., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes & development. 19, 2816-2826 (2005).
- Fasolo, J., Snyder, M. Protein microarrays. Methods Mol. Biol. 548, 209-222 (2009).
- Im, H., Snyder, M., Coligan, J. E., et al. Preparation of recombinant protein spotted arrays for proteome-wide identification of kinase targets. Current protocols in protein science. 27, Unit 27 24 (2013).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
