Probing ad alta densità di microarrays della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina
Summary
Utilizzando microarray proteici contenenti quasi tutta la S. cerevisiae proteoma è sondato per un rapido interrogatori imparziale di migliaia di interazioni proteina-proteina in parallelo. Questo metodo può essere utilizzato per la proteina-piccola molecola, modificazione post-traslazionale, e altri saggi in high-throughput.
Abstract
Ad alta densità di microarrays della proteina funzionali contenenti ~ 4.200 proteine ricombinanti di lievito vengono esaminati per le interazioni proteina-proteina chinasi utilizzando una proteina di fusione purificate per affinità lievito chinasi contenente un tag V5-epitopi per read-out. Chinasi purificata è ottenuto attraverso la cultura di un ceppo di lievito ottimizzato per alta copia la produzione di proteine ospitare un plasmide contenente una fusione chinasi-V5 costruire sotto un elenco indirizzi globale promotore inducibile. Il lievito viene coltivato in mezzi restrittiva con una fonte di carbonio neutro per 6 ore seguita da induzione con 2% galattosio. Successivamente, la coltura è raccolta e chinasi è purificato mediante affinità standard di tecniche cromatografiche per ottenere una proteina chinasi altamente purificata per uso nel saggio. La chinasi purificata è diluita con tampone chinasi ad una gamma appropriata per il dosaggio e microarray della proteina sono bloccate prima ibridazione con il microarray della proteina. Dopo l'ibridazione, gli array vengono sondati con un anticorpo monoclonale V5 ANTIBody per identificare le proteine legate dalla proteina chinasi-V5. Infine, gli array vengono sottoposti a scansione utilizzando uno scanner microarray standard ei dati vengono estratti per l'informatica a valle dell'analisi 1,2 per determinare una elevata fiducia insieme di interazioni proteiche per la convalida a valle in vivo.
Introduction
La necessità di effettuare analisi globali di biochimica delle proteine e di attività in vivo legame ha portato allo sviluppo di nuovi metodi di profiling interazioni proteina-proteina (PPI) e le modificazioni post-traduzionali di proteomi interi 1,3-8. Microarrays proteine sono prodotte come microarray proteici funzionali utilizzando proteine funzionali full-length 4-6,8,9 o microarrays della proteina analitiche contenenti anticorpi 10,11. Essi sono progettati per contenere una alta densità di proteine disposte su vetrini da microscopio con una varietà di chimiche superficiali per facilitare una varietà di condizioni sperimentali necessari per condurre ampio biochimico analisi 12. Nitrocellulosa e di superficie aldeide chimiche per il fissaggio chimico tramite lisina o attaccamento affinità metodi come diapositive chelati nichel per fissare le proteine His-tag e glutatione per il fissaggio affinità tra gli altri 13. </p>
L'uso di microarray della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina richiede l'accesso a una elevata qualità library proteina funzionale 14. S. cerevisiae è suscettibile di produrre una tale biblioteca attraverso l'abbinamento di alta copia affinità tagged costrutti di proteine ad alto throughput tecniche di purificazione cromatografica. La stragrande maggioranza del genoma del lievito è stato sequenziato e quasi l'intero proteoma può essere espresso da un plasmide alta copia per la purificazione e biochimico analisi 12. Una volta che le proteine sono ottenuti e disposte in formato da 384 pozzetti, vengono stampate su un vetrino da microscopio che permette una rapida analisi biochimica multi-parametrica parallelo e interrogatori bioinformatica 8,14-16. Microarrays della proteina sono stati utilizzati per saggi enzimatici e interazioni con proteine, lipidi, piccole molecole, e acidi nucleici tra molte altre applicazioni. L'accessibilità delle proteine sulla superficie del proteomaarray li rendono suscettibili di diversi tipi di rilevazione analitica, tra cui, immuno-affinità, risonanza plasmonica di superficie, fluorescenza e molte altre tecniche. Inoltre, esso consente un controllo preciso della condizione sperimentale dove potrebbe essere difficile da fare in vivo.
L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare l'uso appropriato di microarrays della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina. Questa applicazione consente l'analisi biochimica in parallelo ad alta produttività delle attività di legame alle proteine usando un analita altamente purificato (proteina) di interesse. Una C-terminale (carbossi-terminale) etichettato V5-fusione esca proteina di interesse è prodotta da un plasmide alta copia in un ceppo di lievito ottimizzato per la purificazione della proteina. C-terminale codifica assicura che l'intera lunghezza proteina è stato tradotto. La proteina utilizzata in questo studio è TDA1-V5 proteina di fusione chinasi, che viene potabilizzata con resina nichel affinità tramite un tag His6X. La costru fusione TDA1-V5t è purificato tramite eluizione seriale utilizzando un gradiente di imidazolo per eluire la frazione più altamente arricchito per l'uso nel saggio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo è stato originariamente presentato effettuata utilizzando 85 proteine del lievito proteine chinasi-V5 fusione unica di confrontare attività di legame attraverso distinte famiglie e connessi di protein chinasi lievito conseguente individuazione di nuove reti di interazione in vivo chinasi 1. Come un emergente tecnologia profilazione proteomica, lo sviluppo di High Throughput (HTP) proiezione del proteoma usando microarrays della proteina invocato librerie peptidiche e eucar…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the NIH. The assays shown in Figure 1 was performed by Dr. Joseph Fasolo. We thank Dr. Rui Chen for helpful comments.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Petri Dishes | VWR | NC-10747 | or comparable |
| Bacto yeast extract | Difco | 0217-17 | |
| Bacto peptone | Difco | 0118-17 | |
| Bacto agar | Difco | 0140-01 | |
| Dextrose | Sigma | D9434 | |
| Raffinose | Sigma | R0514 | |
| Galactose | Sigma | G0750 | |
| Sc-Ura drop out media | MP Bio | 114410622 | |
| Small Culture tubes | VWR/Fisher | ||
| Large Erlenmeyer Flask | VWR/Fisher | ||
| Centrifuge JA-10 rotor | |||
| Centrifuge tubes (500 mL) | |||
| Falcon tube (50 mL) | VWR/Fisher | 21008-951 | |
| PBS Tablets | Sigma | P4417 | |
| FastPrep Tubes(2ml screw cap tube) | |||
| FastPrep Machine | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Zircon Beads | BioSpec | 11079105 | |
| Triton X100 | Sigma | P4417 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| Imidazole (pH = 7.4) | Sigma | I5513 | |
| PMSF | Sigma | 93482 | |
| Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free) | Roche | 11873580001 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail 1 | sigma | P2850 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| ATP | Sigma | A1852 | |
| Shaking Incubator (30 °C) | |||
| Nickel Affinity Resin | Life Technologies | R901-01 | |
| G25 column | GE life sciences | 27-5325-01 | |
| Nutator | VWR/Fisher | ||
| SDS-PAGE Gel (NuPage) | Life Technologies | ||
| Coomassie Blue Stain | Life Technologies | ||
| Monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | R960-25 | |
| Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | 451098 | |
| Protein Microarrays Kit | Life Technologies | PAH0525013 | |
| Genepix Scanner | Molecular Devices | ||
| Lifter Slips | Thomas Scientific | http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/ | |
| Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) |
Add the reagents to 1 X PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution | ||
| Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20 | Add the reagents to 1 X PBS to obtain the desired volume of blocking buffer | ||
| Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl,500 μM ATP (for kinases), 1% BSA | Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2 | Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) | Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 – 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| 3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and 60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol) | galactose should not be autoclaved |
Referências
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