Sondering hög densitet funktionellt protein Microarrays att upptäcka protein-proteininteraktioner
Summary
Använda protein mikroarrayer innehållande nästan hela S. cerevisiae proteom sonderas för snabb opartisk förhör av tusentals protein-protein interaktioner parallellt. Denna metod kan användas för protein liten molekyl, posttranslationell modifiering, och andra analyser i hög genomströmning.
Abstract
Hög densitet funktionella protein-mikroarrayer innehållande ~ 4200 rekombinanta jästproteiner undersöks med avseende kinas protein-proteinväxelverkningar med användning av en affinitetsrenad jästkinasfusionsprotein innehållande en V5-epitop-taggen för utläsning. Renat kinas erhålles genom odling av en jäststam optimerad för hög kopia proteinproduktion som hyser en plasmid innehållande en kinas-V5 fusionskonstruktion enligt en GAL inducerbar promotor. Jästen odlas i restriktiv media med en neutral kolkälla under 6 timmar följt av induktion med 2% galaktos. Därefter odlingen skördas och kinas renas med användning av standard affinitetskromatografiska tekniker för att erhålla en höggradigt renad proteinkinas för användning i analysen. Det renade kinas späds med kinasbuffert till ett lämpligt område för analysen och protein microarrays blockeras före hybridisering med protein microarray. Efter hybridiseringen, är uppsättningarna sonderades med monoklonal V5 AntibODY att identifiera proteiner bundna av kinas-V5-protein. Slutligen arrayer skannas med en vanlig microarray scanner, och data extraheras för informatik nedströms analys 1,2 för att bestämma ett högt förtroende uppsättning proteininteraktioner för validering nedströms in vivo.
Introduction
Behovet av att genomföra globala analyser av proteinbiokemi och bindande aktivitet in vivo har resulterat i utvecklingen av nya metoder för profilering protein-proteininteraktioner (protonpumpshämmare) och posttranslationella modifieringar av hela proteom 1,3-8. Protein mikroarrayer tillverkas som funktionellt protein mikroarrayer använder fullängds funktionella proteiner 4-6,8,9 eller analytiska protein mikroarrayer innehållande antikroppar 10,11. De är konstruerade för att innehålla en hög densitet av proteiner anordnade på objektglas med en mängd yta kemier för att underlätta en mängd olika experimentella villkor som krävs för att genomföra omfattande biokemiska analyser 12. Nitrocellulosa och aldehyd yta kemier för kemisk bindning genom lysin eller affinitet fäst metoder såsom nickel- kelatbundna diabilder för att fästa His-märkta proteiner och glutation för affinitets fäste bland andra 13. </p>
Användningen av funktionellt protein microarrays för att detektera protein-proteininteraktioner kräver tillgång till en högkvalitativ funktionellt protein bibliotek 14. S. cerevisiae är mottaglig för att producera ett sådant bibliotek genom parning av hög kopia affinitet taggade protein konstruktioner med hög genomströmning kromatografiska reningstekniker. Den stora majoriteten av jästgenomet har sekvenserats och nästan hela proteomet kan uttryckas från en hög-kopia plasmid för rening och biokemiska analyser 12. När proteinerna erhålles och ordnade i 384-brunnsformat, de trycks på ett objektglas som möjliggör snabb parallell fler parametrisk biokemisk analys och bioinformatik förhör 8,14-16. Protein-mikroarrayer har använts för enzymatiska analyser och interaktioner med proteiner, lipider, små molekyler och nukleinsyror bland många andra tillämpningar. Tillgängligheten av proteiner på ytan av proteometmatriser gör dem mottagliga för olika typer av analytisk detektion inklusive, immun affinitet, ytplasmonresonans, fluorescens och många andra tekniker. Dessutom tillåter den för finreglering av experimentella tillstånd där det kan vara svårt att göra in vivo.
Syftet med detta protokoll är att visa lämplig användning av funktionellt protein microarrays för att detektera protein-proteininteraktioner. Denna applikation gör det möjligt för hög genomströmning parallell biokemisk analys av proteinbindningsaktiviteter med en högrenat analyt (protein) av intresse. En C-terminalt (karboxiterminala) taggade V5-fusionsbetesprotein av intresse framställs från en hög-kopia plasmid i en jäststam optimerad för proteinrening. C-terminala märkning säkerställer att fullängdsproteinet har översatts. Det protein som används i denna studie är Tda1-V5-fusionsproteinkinas, som renas med användning av nickel affinitetsharts via en His6X tagg. Den Tda1-V5-fusions byggt renas genom seriell eluering med användning av en imidazol-gradient för att eluera den högst anrikade fraktionen för användning i analysen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet presenteras ursprungligen utfördes med användning av 85 unika jäst proteinkinas-V5 fusionsproteiner för att jämföra bindningsaktivitet över distinkta och besläktade familjer av jäst proteinkinaser som resulterar i att identifiera nya kinas interaktions nätverk in vivo 1. Som en framväxande proteomik profilering teknik, utveckling av hög genomströmning (HTP) screening av proteom användning av protein mikroarrayer åberopas peptidbibliotek, och eukaryota och prokaryota modello…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the NIH. The assays shown in Figure 1 was performed by Dr. Joseph Fasolo. We thank Dr. Rui Chen for helpful comments.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Petri Dishes | VWR | NC-10747 | or comparable |
| Bacto yeast extract | Difco | 0217-17 | |
| Bacto peptone | Difco | 0118-17 | |
| Bacto agar | Difco | 0140-01 | |
| Dextrose | Sigma | D9434 | |
| Raffinose | Sigma | R0514 | |
| Galactose | Sigma | G0750 | |
| Sc-Ura drop out media | MP Bio | 114410622 | |
| Small Culture tubes | VWR/Fisher | ||
| Large Erlenmeyer Flask | VWR/Fisher | ||
| Centrifuge JA-10 rotor | |||
| Centrifuge tubes (500 mL) | |||
| Falcon tube (50 mL) | VWR/Fisher | 21008-951 | |
| PBS Tablets | Sigma | P4417 | |
| FastPrep Tubes(2ml screw cap tube) | |||
| FastPrep Machine | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Zircon Beads | BioSpec | 11079105 | |
| Triton X100 | Sigma | P4417 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| Imidazole (pH = 7.4) | Sigma | I5513 | |
| PMSF | Sigma | 93482 | |
| Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free) | Roche | 11873580001 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail 1 | sigma | P2850 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| ATP | Sigma | A1852 | |
| Shaking Incubator (30 °C) | |||
| Nickel Affinity Resin | Life Technologies | R901-01 | |
| G25 column | GE life sciences | 27-5325-01 | |
| Nutator | VWR/Fisher | ||
| SDS-PAGE Gel (NuPage) | Life Technologies | ||
| Coomassie Blue Stain | Life Technologies | ||
| Monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | R960-25 | |
| Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | 451098 | |
| Protein Microarrays Kit | Life Technologies | PAH0525013 | |
| Genepix Scanner | Molecular Devices | ||
| Lifter Slips | Thomas Scientific | http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/ | |
| Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) |
Add the reagents to 1 X PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution | ||
| Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20 | Add the reagents to 1 X PBS to obtain the desired volume of blocking buffer | ||
| Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl,500 μM ATP (for kinases), 1% BSA | Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2 | Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) | Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 – 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| 3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and 60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol) | galactose should not be autoclaved |
Referências
- Fasolo, J., et al. Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes. Genes. 25, 767-778 (2011).
- Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays. Genome biology. 7, R110 (2006).
- Breitkreutz, A., et al. A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast. Science. 328, 1043-1046 (2010).
- Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, 141-147 (2002).
- Jeong, J. S., et al. Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray. Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293, 2101-2105 (2001).
- Ptacek, J., et al. Global analysis of protein phosphorylation in yeast. Nature. 438, 679-684 (2005).
- Haab, B. B. Antibody arrays in cancer research. Molecular & cellular proteomics. Mol Cell Proteomics. 4 (4), 377-383 (2005).
- Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays–an emerging tool in cancer proteomics. The international journal of biochemistry & cell biology. 39, 1305-1317 (2007).
- Berrade, L., Garcia, A. E., Camarero, J. A. Protein microarrays: novel developments and applications. Pharmaceutical research. 28, 1480-1499 (2011).
- Balboni, I., Limb, C., Tenenbaum, J. D., Utz, P. J. Evaluation of microarray surfaces and arraying parameters for autoantibody profiling. Proteomics. 8, 3443-3449 (2008).
- Gelperin, D. M., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes & development. 19, 2816-2826 (2005).
- Fasolo, J., Snyder, M. Protein microarrays. Methods Mol. Biol. 548, 209-222 (2009).
- Im, H., Snyder, M., Coligan, J. E., et al. Preparation of recombinant protein spotted arrays for proteome-wide identification of kinase targets. Current protocols in protein science. 27, Unit 27 24 (2013).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
