A homeostase do cálcio do retículo endoplasmático é interrompida em diversas patologias. Um repórter de proteína de monitoramento de cálcio ER secretado (SERCaMP) pode ser usado para detectar interrupções no armazenamento de cálcio ER. Este protocolo descreve o uso de um SERCaMP de Gaussia luciferase para examinar a homeostase do cálcio do RE in vitro e in vivo.
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Artigo de método
Monitoramento retículo endoplasmático homeostase do cálcio Usando um
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Resumo
Resumo
O retículo endoplasmático (ER) contém o mais alto nível de cálcio intracelular, com concentrações de aproximadamente 5000 vezes maior do que os níveis citoplasmáticos. Um controlo apertado sobre ER cálcio é imprescindível para o dobramento de proteínas, modificação e tráfico. Perturbações para Er cálcio podem resultar na activação da resposta proteína desdobrada, um mecanismo de resposta de stress do ER de três pinos, e contribuir para a patogénese de uma variedade de doenças. A capacidade de controlar alterações ER cálcio durante o início e progressão da doença é importante, em princípio, no entanto, um desafio na prática. Métodos actualmente disponíveis para o monitoramento ER cálcio, tais como corantes e proteínas fluorescentes dependentes de cálcio, têm fornecido uma visão sobre a dinâmica ER cálcio nas células, porém essas ferramentas não são adequados para estudos in vivo. O nosso laboratório demonstrou que uma modificação para o terminal carboxi de Gaussia luciferase confere secreção do repórter em resposta aDepleção de cálcio ER. Os métodos para a utilização de uma base de luciferase, proteína secretada ER monitorização de cálcio (SERCaMP) in vitro e in vivo em aplicações são aqui descritos. Este vídeo destaca injeções hepáticas, manipulação farmacológica de Gluc-SERCaMP, coleta e processamento do sangue e os parâmetros de ensaio para acompanhamento longitudinal de ER cálcio.
Introdução
O funções em muitas capacidades celulares, incluindo o dobramento de proteínas, a secreção de proteínas, a homeostase lipídica e de sinalização intracelular 1 retículo endoplasmático (ER). Central para a função ER normal é manter as concentrações de cálcio luminais em ~ 5.000 vezes aqueles encontrados no citoplasma 2-4. Este processo intensivo de energia é regulada pela ATPase sarco / retículo endoplasmático de cálcio (SERCA), uma bomba que move íons de cálcio para o ER. O efluxo de cálcio do RE é mediada principalmente pela rianodina (RyR) e trifosfato de inositol (IP3R receptores). Uma vez que muitos processos de ER são dependentes de cálcio, ....
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Protocolo
1. Ensaio In Vitro: Detecção SERCaMP de lançamento de uma linha celular SH-SY5Y Estável
- Placa SH-SY5Y-gluc-ASARTDL (SERCaMP) em placas de cultura de tecidos tratados com 150.000 células por cm2 de área de superfície. Para placas de 96 cavidades, por exemplo, sementes de 50.000 células por poço (Figura 1A). Crescer as células SH-SY5Y em DMEM (alto teor de glucose, GlutaMAX, piruvato) + 10% de soro de crescimento bovina + 1x penicilina / estreptomicina.
- As células da passagem até 15 vezes (Figura 1B). Número passagem superior não foi testado.
- E volta para as células incubadora humidific....
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Resultados
O método Gluc-SERCaMP permite a avaliação da homeostase do cálcio ER por amostragem líquidos extracelulares. Vários controlos podem ser incluídos no desenho experimental para melhorar a interpretação dos resultados. Em primeiro lugar, a utilização de um repórter constitutivamente segregada (por exemplo, sem a glic ASARTDL C-terminal ou "n-gluc Tag") podem ser empregues para avaliar os efeitos dos tratamentos experimentais sobre a via secretora (secreção celular global) e de expressão do transgene. Por.......
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Discussão
Este protocolo destaca o in vitro e in vivo da utilidade glic-SERCaMP para monitorar a depleção de cálcio ER. Embora a modificação de proteínas para gerar SERCaMP parece generalizar a outras proteínas repórter 12, optamos Gaussia luciferase por sua robusta (200-1.000 maior vezes) bioluminescência em comparação com outras luciferases 18. Nós demonstramos detectável libertação induzida por thapsigargin Gluc-SERCaMP através de uma gama de doses 100 vezes de vírus Gluc-SERCaMP entregu.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional de Abuso de Drogas. Agradecemos a Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno e Josh Hinkle por suas contribuições para o desenvolvimento deste método.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de 1,5 ml | Fisher | 02-682-550 | |
| Solução 10% NP-40 | Pierce | 28324 | para ensaios intracelulares de GLuc |
| Seringas Luer-Lok de 1 ml | Fisher | 14-823-30 | |
| Pontas de filtro de 200 microlitros | Rainin | RT-L200F | |
| 3-0 Agulhas | Fisher | NC9598192 | |
| 30 G Fisher | Scientific | 14-821-13A | |
| Folhas adesivas de vedação de microplacas | Thermo | AB-0558 | |
| Almofadas de preparação de álcool | Fisher | 22-246-073 | |
| Sistema de fluxo automático de anestesia | EZ Anestesia | EZ-AF9000 | |
| Câmara de recuperação de animais | Lyon Vet | ICU-912-004 | |
| Suplemento B27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| Solução Betadine | Fisher | NC9386574 | |
| Bleach | Clorox | n/a | |
| Soro de crescimento bovino | Thermo | SH30541.03 | |
| Coelenterazine, Native | Regis Technologies | 1-361204-200 | |
| Aplicadores com ponta de algodão | Puritan | 806-WC | |
| Agulhas de corte Suturas circulares de 3/8 | WPI | 501803 | |
| Limpador ultrascônico digital | Fisher Scientific | FS60D | |
| DMEM glicose alta, GlutaMAX, piruvato | Life Technologies | 10569-010 | |
| Escada de massa de DNA | Life Technologies | 10496-016 | |
| Gaussia luciferase (proteína recombinante) | Nanolight | 321-100 | |
| Gaussia luciferase anticorpo (para WB, ICC ou IHC) | New England Biolabs | E8023S | 1:2,000 (WB) |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | DS-401 | |
| Placas de ensaio Gluc (96 poços, opacas) | Fisher | 07-200-589 | |
| Solução salina balanceada de Hank | Life Technologies | 14175-095 | |
| Heparina | Allmedtech | 63323-276-02 | |
| Isoflurane | Butler Schein | 29404 | |
| Cetamina | Henry Schein | 995-2949 | |
| Kwik Stop Mordomo em pó hemostático | Schein | 5867 | |
| L-glutamina | Sigma | G8540 | |
| Metanol | Fisher a452-4 | ||
| Centrífuga Microfuge 22R | Bekman Colter | 368831 | |
| Neosporin | Fisher | 19-898-143 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nikon Stereoscope | Nikon | SMZ745T | |
| Nucleospin Gel e PCR Cleanup | Pipeta Machery-Nagel | 740609 | |
| P200 | Rainin | L-200XLS+ | |
| p24 Lenti-X kit de titulação rápida | Clontech | 632200 | |
| Selo de filme PCR | Fisher | AB0558 | |
| Penicilina/estreptomicina | Coquetel de | 15140-122 | |
| Sigma | P8340 | ||
| E-Z Anesthesia | EZ-258 | ||
| Lâminas de bisturi, #10 | Ferramentas de ciência fina Inc | 10010-00 | |
| Ratos SD 150-200 g | Charles River | Ratos | ratos encomendados a 150-200 g. Cirurgia 5 dias após a chegada |
| Brincos para pequenos animais | National Band and Tag co | 1005-1 | |
| Campos cirúrgicos estéreis | Braintree Scientific | SP-MPS | |
| Synergy 2 leitor de placas | BioTek | n/a | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | prejudicial a |
| Mistura de embalagens lentivirais de Virapower | Technologies | K4975-00 | |
| Xfect Transfection reagente | Clontech | 631318 | |
| Xylazine | Valley Vet | 468RX |
Referências
- Sitia, R., Braakman, I. Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory. Nature. 426 (6968), 891-894 (2003).
- Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38<....
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Reimpressões e permissões
