Abstract
Det endoplasmatiske retikulum (ER) inneholder det høyeste nivået av intracellulært kalsium, ved konsentrasjoner omtrent 5000 ganger større enn cytoplasmatiske nivåer. Stram kontroll over ER kalsium er viktig for proteinfolding, modifikasjon og trafficking. Perturbasjoner til ER kalsium kan resultere i aktivering av den ufoldede protein respons, en tre-spiss ER stress svar mekanisme, og bidrar til patogenese i en rekke sykdommer. Evnen til å overvåke ER kalsium forandringer i løpet av sykdomsutbruddet og progresjon er viktig i prinsippet, men likevel vanskelig i praksis. For tiden tilgjengelige metoder for overvåking ER kalsium, for eksempel kalsium-avhengige fluorescerende fargestoffer og proteiner, har gitt innsikt i ER kalsium dynamikken i cellene, men disse verktøyene er ikke godt egnet for in vivo studier. Vårt laboratorium har vist at en modifikasjon av den karboksy-terminale ende av Gaussia luciferase confers sekresjon av reporter i respons tilER kalsium uttømming. Metodene for anvendelse av en luciferase basert, utskilte ER kalsium overvåkning protein (SERCaMP) for in vitro og in vivo anvendelser er beskrevet heri. Denne videoen fremhever lever injeksjoner, farmakologisk manipulering av Gluc-SERCaMP, blod innsamling og prosessering, og analyseparametere for langsgående overvåking av ER kalsium.
Introduction
Endoplasmatisk retikulum (ER) fungerer på mange cellulære kapasiteter, inkludert proteinfolding, protein sekresjon, lipid homeostase, og intracellulær signale en. Sentralt i normal ER funksjon er å opprettholde luminale kalsiumkonsentrasjoner på ~ 5000 ganger de funnet i cytoplasma 2-4. Denne energikrevende prosess er regulert av Sarco / endoplasmatiske retikulum kalsium ATPase (SERCA), en pumpe som flytter kalsiumioner inn på akuttmottaket. Utstrømming av kalsium fra ER medieres primært av ryanodine (RyR) og inositol trifosfat (IP3R) reseptorer. Fordi mange ER prosesser er avhengige av kalsium, kan forstyrre butikken føre til ER stress og eventuell celledød.
ER kalsium dysregulation har blitt observert i sykdommer inkludert kardiomyopati, diabetes, Alzheimers og Parkinsons 5. På grunn av den progressive karakter av disse sykdommene er det blitt vanskelig å avgrense årsak-virkning relationship mellom patogenesen og endringer i ER kalsium butikken. En rekke teknologier har tillatt for betydelige fremskritt i vår forståelse av ER kalsium dynamikk, inkludert fargestoffer og genetisk kodede kalsium indikatorer (GECIs). Lavaffinitets kalsiumfargestoffer, som øker i fluorescens når de er bundet til Ca 2+, kan lastes inn i celler for å undersøke subcellulære lommer med høy konsentrasjon av kalsium 6. GECIs, slik som D1ER og Catcher tillate overvåkning av kalsium svingninger med mer presis styring av subcellulære lokalisering 7-9. Nylig, en annen klasse av GECIs kalles kalsium-måling organelle-omsluttet protein indikatorer (CEPIA) har blitt beskrevet 10. En tredje metode som kombinerer genetikk og lite molekyl kjemi er rettet-esterase fargestoff laste (TED), som benytter en genetisk kodet karboksylesterase (målrettet til ER) med en ester-basert kalsium fargestoff 11.
Mens aforementioned tilnærminger har iboende styrker og svakheter, de kan gi verdifull innsikt i ER kalsium dynamikk gjennom akutte målinger av fluorescens. De er imidlertid ikke optimal for de langsgående studier ofte nødvendig å undersøke sykdomsprogresjon. Med mål om å utarbeide en metode for å overvåke kalsium dynamikk over lengre tid, har vi identifisert og utviklet et protein modifikasjon for å lage de skilles ER kalsium overvåkings proteiner (SERCaMPs) 12.
SERCaMP omgår flere begrensninger forbundet med andre metoder, ved å gi en minimal invasiv tilnærming til gjentatte ganger avhøre ER kalsium butikken. Vi har tidligere demonstrert at den karboksy-terminale peptid ASARTDL (alanin-serin-alanin-arginin-treonin-aspartinsyre-leucin) er tilstrekkelig til å fremme ER retensjon; imidlertid, under betingelser som fører til reduksjon i ER kalsium, er peptidsekvensen ikke lenger i stand til å beholde ER localization og proteinet blir utskilt 13. Grunnlaget for SERCaMP teknologi er vedheng av ASARTDL til den karboksy-terminale ende av et utskilt protein (f.eks Gaussia luciferase, eller Gluc), slik at sekresjon utløses av ER kalsiummangel, og dermed skape en robust reporter av ER kalsium dysregulering 12. Ekspresjon av Gluc-SERCaMP via transgene metoder gjør det mulig for biologiske væsker, inkludert cellekulturmedium og plasma som skal analyseres for endringer i Gluc aktivitet som en indikator på ER kalsium homeostase. Fremgangsmåten har anvendelser for den langsgående studium av progressive endringer i ER kalsium butikken både in vitro og in vivo. Følgende protokoll er skrevet som en generell oversikt for bruk Gluc baserte SERCaMP å studere ER kalsiumhomeostase, men protokollen kan fungere som en guide for alternative reporter SERCaMPs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. In Vitro analyse: Oppdager SERCaMP Løslatelse fra Stable SH-SY5Y cellelinje
- Plate SH-SY5Y-Gluc-ASARTDL (SERCaMP) i vevskultur behandlede plater på 150.000 celler pr cm2 overflateareal. I 96 brønners plater, eksempelvis frø 50.000 celler per brønn (figur 1A). Grow SH-SY5Y celler i DMEM (høy glukose, Glutamax, pyruvat) + 10% storfe vekst serum + 1x penicillin / streptomycin.
- Passasje celler inntil 15 ganger (figur 1B). Høyere passasje antallet har ikke blitt testet.
- Vende tilbake til cellene fuktet inkubator ved 37 ° C med 5,5% CO2 og inkuber over natten.
- Før eksperimentell behandling (er), samle en referanseprøve for hver brønn ved å overføre 5 pl av kultursupernatanten til en opak vegger 96-brønners plate. Før innsamling, banke forsiktig på plate på alle sider og virvle å unngå gradient effekter. Tett ugjennomsiktig plate med en selvklebende sealing ark og oppbevares ved 4 ° C inntil tiden for enzymatisk analyse.
Merk: utskilt Gluc-SERCaMP er veldig stabil i cellekulturmedium. Vi har tidligere rapportert omtrent 5-10% av Gluc aktivitet ble tapt etter en 72 timers inkubasjon ved 37 ° C (inkubert på SH-SY5Y-celler) 12. - Unn celler som ønsket å undersøke ER kalsium mangel (f.eks miljø, farmakologiske, genetiske manipulasjoner). Unngå lang eksponering for omgivelsene (utenom den styrte inkubator) som pH-endringer vil raskt finne sted ved atmosfærisk CO 2. Legg HEPES til dyrkningsmediet ved 20 mM, for å stabilisere pH-verdien 14, hvis langvarig manipulasjoner er nødvendig. Unngå eksponering for lys når du bruker HEPES i kulturmedium 15.
- Positiv kontroll: Unn celler med 100 nM thapsigargin (Tg) eller 50 M cyclopiazonic acid (CPA) i 4-6 timer for eksperimenter i SH-SY5Y celler. Maksimal respons i andre cellelinjer kan kreve lengre inkubasjoner eller forskjellig konsensentrasjoner av forbindelser.
- Negativ kontroll: Samle dyrkingsmedium fra foreldre SH-SY5Y celler. Vår erfaring er bakgrunnen luminescens for denne analysen mindre enn 0,05% av basal sekresjon fra stabile SH-SY5Y-Gluc-SERCaMP celler.
- Samle og lagre 5 ul prøver av klimaanlegg media på ønskede tidspunkter, som beskrevet i trinn 1.2.
- Vurdere enzymatisk aktivitet i mediet som skissert i § 5.
- Undersøke intracellulær Gluc av immunoblot eller luminescens analysen.
- For immunoblot: lyse celler i modifisert RIPA-buffer inneholdende 50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 0,25% natriumdeoksykolat, 1 mM EDTA, 1% NP40, og proteaseinhibitorer. Separat på SDS-polyakrylamid gel og overføring til 0,20 mikrometer PVDF membran. Inkuber membran med Gluc-antistoff (1: 2000 fortynning) over natten ved 4 ° C. Utfør sekundære antistoff ruge og membran vasker som per brukerdefinert protokoll for deteksjonsreagens av valget.
- Forluminescens analysen (figur 2): Utfør disse trinnene på is:
- Fjern alt mediet fra brønnene i vevskultur plate og skyll med 200 ul kald PBS.
- Legg 75 ul lyseringsbuffer inneholdende 50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% NP40 og proteaseinhibitorer til hver brønn.
- Rotere platen på en orbital-rystemaskin (120 rpm) ved 4 ° C i 20 min.
- Forsiktig pipette lysatet opp og ned ved hjelp av en multikanalpipette, unngå luftbobler. Overfør 5 mL av lysat til en ugjennomsiktig plate og vurdere luminescens som skissert i § 5.
2. In Vitro-analyse: Forbigående Transfeksjon av udødelig Celler med SERCaMP
Merk: Vi har observert at forbigående transfeksjon prosedyrer kan indusere cellulært stress og sløv den påfølgende Gluc-SERCaMP respons. Den følgende metode ble utviklet for å minimalisere transfeksjon eff stp i SH-SY5Y celler. Optimalisering av denne fremgangsmåten (inkludert valg av transfeksjon reagens) for alternative cellelinjer kan være nødvendig. Når det er mulig, anbefales det å bruke stabile cellelinjer eller viral transduksjon metoder beskrevet i §§ 1 og 3 kroner.
- Plate SH-SY5Y celler i en 100 mm rett på 4 x 10 6 celler. Denne tallerken vil være tilstrekkelig til å re-frø ca 300 brønner (96-brønners plate-format) etter transfeksjon prosedyren.
- Transfektere celler med Xfect reagens ved anvendelse av 20 ug av plasmid-DNA (som koder for Gluc-SERCaMP) og 6 pl av Xfect reagens. Skala DNA og Xfect reagent tilsvarende for større eller mindre kulturskip.
- Vende tilbake til cellene inkubator i 48 timer.
- Trypsineres cellene og reseed til 96-brønners plater ved 60.000 celler per brønn. Følg påfølgende trinnene i § 1.
3. In vitro-analyse: Viral vektor-mediert ekspresjon av Gluc-SERCaMP
telt "> Merk: adenoassosiert viral (AAV) vektor emballasje 16 og rensing 12 og lentivirus produksjon 13 har tidligere blitt rapportert.- Titer Gluc-SERCaMP AAV ved hjelp av følgende primere og prober: forover primer, 5'-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3 '; reverse primer, 5'-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3 '; sonde (5'-6-FAM / 3'-BHQ-1-merket), 5'-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 'for kvantitativ PCR.
- Forbered standardkurven ved å linear et plasmid som inneholder Gluc og rensing av DNA ved hjelp av en spin-kolonne (f.eks Machery-Nagel NucleoSpin Gel og PCR opprydding). Kvantifisere DNA ved separering på en agarosegel sammen med en masse stige. Forbered 1:10 fortynninger av DNA fra 100 pg / ml til 10 fg / ml i PBS. Beregn kopier / ml Gluc plasmid DNA ved hver av konsentrasjonene basert på molekylvekten av plasmidet.
- Fortynn de AAV bestanden i PBS (passende fortynning vil være avhengigparametre for viral forberedelse og bestemmes empirisk).
- Kjør PCR-reaksjon i en real-time PCR-system ved bruk av følgende betingelser: 95 ° C x 5 min, 94 ° C x 20 sekunder, og 60 ° C x 1 min for 41 sykluser. Beregn kopier / ml ved hjelp av standardkurven.
- Titer lentivirus med en p24 Lenti-X rask titer kit. Tine lentivirale alikvoter på is og fortynnes p24 styre proteinet i SH-SY5Y medium.
- Fortynn lentivirus, slik at det vil falle på standardkurven (for eksempel 1: 20000 eller 1: 100 000). Fortynningsfaktoren som kreves vil variere basert på lentiviral forberedelse parametere og må bestemmes empirisk. Følg produsentens instruksjoner for alle påfølgende trinn.
- Plate celler til 96-brønners plater. For SH-SY5Y celler, kan plating prosedyrene beskrevet i kapittel 1 følges. For rotte primære kortikale nevroner, bør cellene isoleres og utsådd på hensiktsmessig belagte plater as tidligere beskrevet 16. Oppretthold rotte primære kortikale nevroner i Neurobasal medium supplert med 1x B27 og 500 mikrometer L-glutamin. Utfør halv mellom børser annenhver dag.
- Transduce cellene med virus. Målet med viral transduksjon er å oppnå lavt nivå uttrykk, som Gaussia luciferase gir robust signal.
- AAV transduksjon SH-SY5Y celler: transduce dagen etter plating. Fortynne AAV til 6,0 x 10 7 vg / ul i AAV fortynningsbuffer (PBS + 0,5 mM MgCl2). Tilsett 5 ul av fortynnet AAV (3,0 x 10 8 vg; MOI på ca. 6000) per brønn i 96 brønners plate (figur 3A). Bruk 10% blekemiddel for å inaktivere viral vektor avfall.
- AAV transduksjon av rotte primære kortikale nevroner: transduce 6-8 dager etter plating. Fortynne AAV til 4,0 x 10 6 vg / ul i AAV fortynningsbuffer. Tilsett 5 mL fortynnet AAV (2,0 x 10 7 vg; MOI på ca 350) per brønn96-brønners plate (figur 3B). Den optimale MOI skal bestemmes empirisk for andre celletyper. Bruk 10% blekemiddel for å inaktivere viral vektor avfall.
- Lentiviral transduksjon av SH-SY5Y celler: transduce dagen etter plating. Fortynn lentivirus til 20 pg / mL p24 (konsentrasjonen bestemmes ved hjelp av Titering kit) i Hanks balanserte saltoppløsning. Legg 5 ul av fortynnet virus per brønn (100 pg av p24, som tilsvarer 1.250.000 lentiviral partikler, eller ~ 1250 IFUs) av en 96-brønners plate inneholdende 100 ul volum. Skalere tilsvarende for større formater. Bruk 10% blekemiddel for å inaktivere viral avfall.
- Samle en forbehandling prøve av medium og begynne eksperimentell behandling 48 timer (SH-SY5Y) eller 5-7 dager (rotte primære kortikale nevroner) etter transduksjon.
4. I Vivo SERCaMP analyse
Merk: Før du utfører noen animalske prosedyrer være sikker på å få riktig godkjenning gjennom din institusjon. Altoverlevelse operasjoner som skal utføres under sterile betingelser med adekvat anestesi. Alle prosedyrer som er beskrevet nedenfor er godkjent og er i samsvar med NIH ACUC retningslinjer.
- Autoclave kirurgiske instrumenter før start av kirurgi (121 ° C, 30 min sterilisering, 20 min tørketid). Rengjør alle instrumentene i et ultrasonicator umiddelbart etter alle prosedyrer og før autoklavering. Opprettholde sterile forhold under overleve operasjonen. For operasjoner krever flere dyr, tørk kirurgiske instrumenter med 70% alkohol, ultrasonicate og perle sterilisere mellom rotter. Referere til Materials List for nødvendige instrumenter.
- Forbered rotte for kirurgi. Her bruker vi Sprague-Dawley (180-200 g).
- Bedøve rotter ved hjelp av gass isofluran i 3 minutter (4-5% isofluran levert ved 1000 ml / min), etterfulgt av intraperitoneal injeksjon av xylazin (8 mg / kg) og ketamin (80 mg / kg). Påfør ophthalmic salve for å beskytte hornhinner fra å tørke ut. Begin kirurgi når rotta er dypt bedøvet som demonstrert av mangel på uttak refleks etter halen eller foten klemme.
- Barbere region av magen litt under ribbeina (lav thorax region) til midten av mageregionen. Skrubb kirurgiske området tre ganger, alternerende 70% alkohol og Betadine skrubb. Plasser rotte i liggende stilling på sterile kirurgiske området med sterile kirurgiske forheng.
- Fortynne AAV-Gluc-SERCaMP til 7,6 x 10 9 vg / ml (sluttkonsentrasjon). Bland godt ved å snu røret.
Merk: Utvalg av viruskonsentrasjonen kan variere (figur 4).- Pipette 105 mL fortynnet AAV inn i en steril parabolen. Bruker en 30-gauge nål for å samle viruset i en sprøyte.
- Utføre kirurgi for å eksponere leveren og injisere AAV-Gluc-SERCaMP.
- Før du gjør et snitt i buken, bruke 0,25% bupivacain til innsnitt området. Ved hjelp av en skalpell, lage en horisontal innsnitt under brystkassen (approximately 2-3 cm). Blunt dissekere å skille bindevev fra hypodermis.
- Kutt abdominal muskler, utsette høyre mediale flik av leveren.
Merk: ekstra lapper kan injiseres basert på slutten søknad. - Plasser dyret etter kirurgisk mikroskop og justere for å få rett medial flik av leveren i synsfeltet. Injisere viruset inn parenchyma av mediale lapp; 3 separate områder, ca 33 mikroliter per område.
Merk: La nål i vev for 5-10 sek etter injeksjon for å sikre levering av hele injeksjonsvolum. - Sutur abdominal muskel og hud separat og legge Neosporin bruker bomull tipped applikator. Plasser rotte i et recovery kammer før bevisstheten er gjenvunnet og rotte er i stand til å opprettholde oppreist stilling. Ikke la rotte (r) uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. Huset enkeltvis inntil såret har grodd og sting har blitt fjernet (7-14 dager).
- Begynn halen blod samling 4-7 dager etter injeksjon. Forbered blodoppsamlingsrør av merking og pre-veiing. Tilsett 50 mL heparin (1000 U / ml) til hvert rør.
- Sted rotte i isoflurananestesi kammer i 3 minutter (4-5% isofluran levert ved 1000 ml / min). Fjern rotte fra kammeret og sted i nesekjeglen (2-3% isofluran levert på 500 ml / min). Blodprøvetaking kan begynne når rotta er dypt bedøvet som demonstrert av mangel på uttak refleks følgende hale piNCH.
- Ved hjelp av steril saks klippet halespiss (1-2 mm) og samle bloddråpe-messig i ferdigfylt heparin rør. Blodprøve inntil volumet når større enn 2: 1 blodet til heparin-forhold (> 100 ul blod / 50 mL heparin). Blod volumer kan justeres basert på eksperimentell design. Bruk en våt bomulls applikator å bruke blodstillende pulver til halen for å stoppe blødningen.
- Oppbevar blod rør ved 4 ° C hvis samle påfølgende prøver. Tørk saks med etanol pad og perle sterilisere mellom samlingene.
- Vei prøverør og juster med heparin for å oppnå forholdet 2: 1 (blod, heparin). Dette trinnet vil normalisere mengden av heparin i hver prøve (tabell 1).
- Sentrifugerør ved 2000 xg i 5 min ved 4 ° C. Overfør supernatanten (plasma) til et nytt rør og oppbevares ved -80 ° C inntil tidspunktet for luciferase assay (§ 5).
Note: Lagring av prøvene ved 4 ° C opp til 72 timer før enzymatisk assay har minimal effekt på luminescens (figur 5A). Opp til tre fryse-tine-sykluser av plasmaprøver har ingen effekt på luminescens (figur 5B).
- Thapsigargin administrasjon (positiv kontroll):
- Forbered thapsigargin ved fortynning i etanol til en sluttkonsentrasjon på 2,5 mg / ml. Injisere thapsigargin på 1 mg / kg ip inn i den nedre del av magen.
Merk: Thapsigargin øker trombinindusert plate koagulering 17 og kan gjøre blodprøvetaking fra halen vanskeligere.
- Forbered thapsigargin ved fortynning i etanol til en sluttkonsentrasjon på 2,5 mg / ml. Injisere thapsigargin på 1 mg / kg ip inn i den nedre del av magen.
- Gaussia luciferase assay:
- Tine plasmaprøvene på is.
Merk: For longitudinelle studier, tine og utføre luminescens analysen for alle endepunktet prøvene på samme dag (ved hjelp av enkelt utarbeidelse av underlag). - Overføring 10 mL av plasma til en ugjennomsiktig vegger plate og måle enzymatisk aktivitet som beskrevet i kapittel 5. Kjør 3-4 tekniske replikater av hver plasmaprøve.
- Tine plasmaprøvene på is.
- Euthanasien
Merk: Fordelen med SERCaMP teknologi er evnen til å overvåke langs ER kalsium. Avhengig av eksperimentelle parametre og endepunkt analyser, dyrene skal avlives ved tiltak som passer for endepunkt analyser og i samsvar med institusjonelle ACUC retningslinjer.
5. Luminescence Analyse
- Forbered coelenterazine (CTZ) stamløsninger ved fortynning av forbindelsen i sur metanol (30 pl av 10 N HCl til 3 ml metanol) til 20 mM. Forbered engangs porsjoner og oppbevar ved -80 ° C.
- Forberede arbeids underlaget på dagen for analysen.
- For in vitro-analyser, fortynn coelenterazine til 8 uM i PBS, f.eks legge til 10 pl av 20 mM CTZ lager til 25 ml PBS (figur 6A, B).
- For in vivo-analyser, fortynn coelenterazine til 100 uM i PBS, 500 mM askorbinsyre, 5 mM NaCl.
- Inkuber forberedt CTZ i minst 30 minromtemperatur før du begynner med analysen.
Merk: Dette trinnet er ofte inkludert i Gaussia luciferasepreparater analyser som det er rapportert om raske underlaget forfallet under første 30 min etter å forberede. Vi har ikke observert denne effekten i vårt system (figur 6C); Men vi har ofte inkubasjonen trinnet som vi har funnet noen negativ innvirkning på analysen. - Bruk en plateleser som er i stand til å overvåke bioluminescens og utstyrt med et substrat injektor. Prime linjene med underlaget.
Merk: Den opprinnelige underlaget gjennom linjene kan være utsatt for degradering. For å unngå kunstig lave målinger for tidlige prøver, injisere 20-30 tomme brønner (lasting en tom plate på leseren) før måling eksperimentelle prøver. - Injisere 100 ul substrat inn godt, riste middels hastighet i 5 sekunder, og måle lys utslipp. For Biotek Synergy II plateleser, integrere lysemisjon i løpet av 0,5 sek (in vitro prøver) og 5 sek (ivivo prøver) for lese trinn. Optimalisere plate leser parametere for ideelle analyseytelsen.
Merk: Gaussia luciferasepreparater utstillinger flash kinetikk med rask signal forfallet (i forhold til å gløde kinetikk observert med andre luciferases). Blitsen kinetikk av Gluc påvirkes av serum i cellekulturmedium (figur 7A), fremhever viktigheten av å kontrollere for middels sammensetningen tvers prøver. På grunn av den raske nedbrytning av luminescens etter tilsetting substrat (flash kinetikk), tiden mellom injisere og lese skritt må være ensartet for alle prøvene. Platen leseren bør settes til injisere substrat til et godt, venter en fast tid (for eksempel bruker vi en 5 sek shake trinn), og leser som godt. Tilsetning av substratet til en hel plate før lesing utgjør en betydelig utfordring med mindre substrat kan tilsettes til alle brønner samtidig. Hvis en injektor ikke er tilgjengelig, kan problemet være delvis omgått ved å inkubere platen i 10 minutter mellom substratet Addisjon og måling (og dermed unngår den bratte delen av desintegrasjonskurven) (figur 7B). - Gjenta injeksjon, ventetid, og lese trinnene for hver brønn på tallerkenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den Gluc-SERCaMP metoden gjør for vurdering av ER kalsiumhomøostase ved prøvetaking ekstracellulære væsker. Flere kontroller kan inkluderes i eksperimentell design for å forbedre tolkning av resultater. For det første kan bruk av et konstitutivt utskilt reporter (f.eks Gluc uten den C-terminale ASARTDL eller "Gluc-No-ID") bli anvendt for å vurdere effektene av eksperimentelle behandlinger på den sekretoriske vei (global cellulær sekresjon) og transgen ekspresjon. For eksempel vil en økning av de ekstracellulære nivåer av både Gluc-SERCaMP og Gluc-No Tag betraktes som en tvetydig resultat. Alternativt kan en økning i Gluc-SERCaMP sekresjon med en tilsvarende mangel på Gluc-No Tag reaksjon støtter en ER kalsiumavhengig hendelse (figur 8). Utskillelsen av Gluc-SERCaMP i respons til ER kalsiummangel kan bli ytterligere vurdert ved å måle intracellulær Gluc, selv om dette er begrenset til en enkelt endepunktet som lyse er nødvendig. Int racellular Gluc-SERCaMP vil avta som reaksjon på ER kalsiummangel, da det gradvis utskilt, og det ekstracellulære: intracellulære forholdet (beregnet for hver enkelt brønn) vil øke (figur 2B). Det ekstracellulære: intracellulære forholdet er nyttig for å kontrollere for endringer i transgen ekspresjon.
Farmakologiske modulatorer av ER kalsium butikken kan anvendes for å bekrefte at bidraget av ER kalsium til SERCaMP frigjøring i nye paradigmer. Dantrolen, en RyR-antagonist, er kjent for å stabilisere ER kalsium, som skal redusere eller hemme frigjøring av SERCaMP i respons til Tg (figur 8B). Det anbefales, når det er mulig, for å teste ytterligere forbindelser som påvirker ER kalsium flux (f.eks Xestospongin C, 4-klor-m-kresol) i nye eksperimentelle paradigmer ansette SERCaMP. Disse studiene er ofte utfordrende in vivo, men kan være mulig i tilsvarende vevskultur-modeller.
"> For in vitro-studier med Gluc baserte SERCaMP, anbefales å beregne svar på enkeltplater sammenlignet med kontrollgruppen (e). Kan The 'behandling-indusert' respons vurderes over tidsforløpet ved å spore endringer i relativ respons versus kontroll ( for mellom-plate sammenligninger). Den er ikke tilrådelig å sammenligne rå tall på tvers av flere plater, på grunn av forfallet av underlaget, noe som kan føre til endringer i de rå verdier mellom tidspunkter (figur 6C). Making relative sammenligninger innenfor en plate minimerer denne effekten (figur 6D). Et eksempel på analyse av data for en in vitro-Tg-indusert SERCaMP frigjøringsforsøket er vist i figur 9.For in vivo studier med Gluc-SERCaMP, bør data vurderes uavhengig for hvert dyr, med alle dyr fungerer som sin egen "pre-behandling 'kontroll. Dette er nødvendig for å ta hensyn til variasjoner i transgenet delivery og uttrykk mellom dyr (Figur 4A).
Størrelsen av SERCaMP responser vil bli påvirket av en rekke faktorer, hvorav mange er relatert til grunnlinjen helsen av cellene og kan direkte kontrolleres av undersøkeren. For maksimal SERCaMP respons, er det viktig å optimalisere forholdene som favoriserer basal ER kalsiumhomeostase. Dette inkluderer seeding celler ved optimal tetthet og bruk av lave virustiter. Ulike celle- og vevstyper kan ha tilleggskrav som bør bestemmes empirisk.
Fig. 1: Stabil SH-SY5Y cellelinje seeding tetthet og gjennomgangstallavfall (A) SH-SY5Y-Gluc-SERCaMP celler ble sådd ved forskjellige tettheter og inkubert i 40 timer. Utskilt Gluc-SERCaMP ble målt 4 timer etter behandling med 300 nM Tg or bærerkontroll (gjennomsnitt ± SD, n = 6). Thapsigargin-indusert økning i Gluc-SERCaMP sekresjon er indikert for hver celle tetthet. (B) SH-SY5Y-Gluc-SERCaMP cellene ved passasje nummer 2 og 15 ble undersøkt for thapsigargin-indusert sekresjon. Celler ble behandlet med 100 nM Tg i 2 timer eller 4 timer, og skilles Gluc-aktivitet ble normalisert til bærerbehandlede kontroller (gjennomsnitt ± SD, n = 4, ingen signifikant effekt av passasje-faktor, 2-veis ANOVA). Stiplet linje angir y = 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 2: Enzymatisk analyse for måling av intracellulært Gluc-SERCaMP (A) Intracellulære og (B) Gluc ekstracellulære enzymatiske aktivitet ble vurdert i rotte primær cortiske nevroner (transduserte med AAV-Gluc-SERCaMP). Seks dager etter transduksjon, ble cellene behandlet med 60 nM thapsigargin i 4 timer. Som Gluc-ASARTDL akkumuleres i mediet, blir tilsvarende reduksjon i intracellulære nivåer observert. (C) Et forhold mellom ekstracellulær: intracellulær Gluc aktivitet kan beregnes for hver enkelt brønn.
Fig. 3: AAV-Gluc-ASARTDL titer versus thapsigargin-indusert respons for SH-SY5Y-celler og rotte primære kortikale nevroner (A) SH-SY5Y celler ble sådd i 96-brønners plater ved 5 x 10 4 celler pr brønn og tillates å følge over natten. Celler ble transdusert ved den angitte multiplisitet av infeksjon (MOI), inkubert i 48 timer og deretter behandlet med 300 nM Tg eller kjøretøy. Luminescens ble målt i mediet etter 8 timer (gjennomsnitt ± SEM, n = 3). * P <0,05, multiple t-tester (Holm-Sidak korreksjon). (B) Rat primære kortikale nevroner ble transdusert på DIV8 med AAV-Gluc-ASARTDL på indikerte MOI (beregnet ved hjelp av 60.000 celler per brønn tilnærming ved transduksjon). Fem dager etter transduksjon, ble cellene behandlet med 100 nM Tg eller bærerkontroll, og luminescens i mediet ble målt etter 8 timer (gjennomsnitt ± SEM, n = 6). * P <0,05, flere t-tester (Holm-Sidak korreksjon).
Fig. 4: Thapsigargin-indusert Gluc-SERCaMP frigivelse i blod etter intrahepatiske injeksjoner enn spekter av virale titere (A) Rå luminescens-verdier fra rotter (n = 8) intrahepatically injisert med forskjellige AAV-Gluc-ASARTDL titere. Thapsigargin (1 mg / kg) injeksjon (ip) administrert på dag 12. Blod ble oppsamlet ved angitte tidspunkter og lagret ved -80 & #176 C inntil tiden for analysen. (B) Normalis luminescens verdier fra panel A, demonstrerer thapsigargin-indusert SERCaMP respons hos rotter (n = 8) uttrykker ulike mengder av AAV-Gluc-ASARTDL.
Fig. 5: Håndtering og lagring av Gluc-SERCaMP plasmaprøver (in vivo) (A) Plasma ble oppsamlet fra rotter intrahepatically uttrykker Gluc-SERCaMP (n = 10), alikvotert og lagret ved -80 ° C inntil tiden for analyser. Rørene ble fjernet fra -80 ° C og lagret ved 4 ° C i angitt tid før luminescens måling (middelverdi ± SD). (B) Effekt av flere fryse / tiner av plasmaprøver på Gluc enzymatisk aktivitet. Plasmaprøver innsamlet fra rotter intrahepatically uttrykker AAV-Gluc-SERCaMP (n = 10) ble utsatt for det angitte antallav fryse-tine-sykluser og undersøkt med hensyn til luminescens (gjennomsnitt ± SD).
Fig. 6: Klar coelenterazine substrat for Gluc-SERCaMP assays (A) Kulturmediet ble samlet opp fra SH-SY5Y-Gluc-SERCaMP cellelinjer som ble behandlet med 300 nM Tg (eller bærerkontroll) i 5 timer. Gluc-aktivitet i mediet ble bestemt ved å injisere PBS + forskjellige konsentrasjoner av coelenterazine (gjennomsnitt ± SD, n = 6). (B) Lumi-nescence verdier fra panel A ble normalisert til bilen behandlet kontroll ved hver substratkonsentrasjon å vurdere thapsigargin-indusert effekt. (C) Substrat nedbrytning i løpet av flere timer. Luminescens fra en kjent mengde av rekombinant Gluc (0,1 ng eller 0,02 ng) ble målt i løpet av flere timer etter fremstilling av substrat (gjennomsnitt ± SD, n = 4). (D) Når den rå luminescens for den rekombinanteGluc redusert over tid på grunn av forråtnelse substrat, ble ganger forskjell i prøvene (som bestemt ved luminescens) opprettholdes.
Figur 7:. Hensyn til Gluc-SERCaMP analyser knyttet til kinetikk av Gluc / CTZ reaksjon (A) Kultur medium endrer forfallet av Gluc / CTZ signal. 5 pl av supernatanten inneholdende Gluc-SERCaMP ble blandet med varierende forhold av PBS og kulturmedium. 100 ul substrat (15 uM CTZ i PBS + 500 mM askorbinsyre) ble tilsatt til 50 ul av prøven ble fortynnet som angitt i tabellen. Lysemisjon ble målt over 15 min. (B) 5 ul medium ble oppsamlet fra SH-SY5Y-Gluc-ASARTDL celler og 100 ul substrat (8 pM CTZ i PBS + 5 mM NaCl) ble tilsatt. Luminescens ble målt umiddelbart etter tilsetning av substrat (T = 0) og hvert 30 sekund i løpet I løpet av 15 min (± SD, n = 12). Dataene er plottet som prosent signal i forhold til det foregående 30 sek intervaller for å vurdere graden av forfall. Det innfelte viser rå luminescens data.
Fig. 8: Farmakologisk bekreftelse av ER kalsiummangel (A) Virkning av 100 nM thapsigargin på Gluc sekresjon ble undersøkt for Gluc-ASARTDL og Gluc-No Tag-kontroll (gjennomsnitt ± SD, n = 6). (B) Stabiliserende ER kalsium med dantrolen (RyR antagonist) hemmer Tg-indusert SERCaMP utgivelse. Celler ble forbehandlet med de angitte konsentrasjoner av dantrolen i 30 minutter eller 16 timer før tilsetning av 100 nM thapsigargin. Gluc-aktivitet i mediet, ble målt etter 4 timer (gjennomsnitt ± SD, n = 6).
99fig9.jpg "/>
Fig. 9: Mock representative resultater for den Gluc-SERCaMP assay merke til kjøretøyet behandlede verdier kan reduseres mellom platene, som følge av nedbrytning substrat (avhengig av tidsintervallet mellom lese de enkelte plater). For å forklare denne effekt, blir behandlingen spesifikk effekt beregnes uavhengig for hver plate, og dette forholdet blir sammenliknet på tvers av platene.
| Dato | Rat | Tube masse (mg) | Heparin volum (ml) | Heparin tetthet (g / ml) | heparin masse (mg) | Masse av rør + heparin (mg) | Totale massen etter blodprøvetaking (mg) | Masse av oppsamlet blod (mg) | Tetthet blod (g / ml) | Beregnet volum blod (ul) | Volum av heparin som er nødvendig for forholdet 2: 1 | ml-ekstra heparin å legge før spin |
| 01.01.15 | SD Mann | 1135,9 | 50 | 1.117 | 55.83 | 1191,73 | 1317,70 | 125,97 | 1.05 | 119,97 | 59.98 | 9,98 |
Tabell 1:. Blood samling tabellen Eksempel på blodprøvetaking loggen for SERCaMP studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen fremhever in vitro og in vivo nytten av Gluc-SERCaMP å overvåke utarming av ER kalsium. Selv om protein modifikasjon til å generere SERCaMP ser ut til å generalisere til andre reporter proteiner 12, valgte vi Gaussia luciferase for sin robuste (200-1000 ganger større) Bioluminescens sammenlignet med andre luciferases 18. Vi viser påvisbar thapsigargin-indusert Gluc-SERCaMP frigivelse over en 100-ganger doseområdet Gluc-SERCaMP virus levert til primær rotte kortikale nevroner, SH-SY5Y-celler, og rotte-lever (figur 3 og 4). Vi har tidligere beskrevet generering av et stabilt transfektert cellelinje som uttrykker Gluc-ASARTDL og viste at så få som 20 celler i en befolkning på 5 x 10 4 umerkede celler kan rapportere en thapsigargin indusert respons 12. Her viser vi at stabil cellelinje kan konsekvent rapportere Tg-indusert respons ut til 15 passasjer, den mest analyzed, noe som indikerer at kontinuerlig uttrykk for reporter over tid ikke påvirke dens evne til å bli utgitt som svar på ER kalsium mangel (figur 1). Våre data indikerer at Gluc-SERCaMP holdes i hovedsak innenfor ER av en celle til en tid av ER kalsium uttømming når det utskilles. Under "normale" betingelser, det er en lav basal sekresjon som tillater etablering av referanse ER kalsiumhomøostase 12. Etter ER kalsium uttømming av thapsigargin, nivåer av intracellulært og ekstracellulært luminescens endring i motsatte retninger. Dette kan uttrykkes som et forhold for å indikere en endring i steady state fordeling av sensoren (figur 2). Viktigere, som SERCaMP frigjøring blir modulert ved KDEL reseptorekspresjon 12, kan størrelsen av frigivelse variere avhengig av celletype. Vi ser for oss at å erstatte 'ASARTDL "med alternative KDEL lignende karboksyende sekvenser kan være nødvendig for å oppnå maximal SERCaMP respons i en spesiell celle eller vevstype.
For in vitro-analyser, vil nivået av ekstracellulær Gluc-SERCaMP akkumuleres over tid på grunn av stabiliteten av det utskilte reporter; vi rapporterte en omtrentlig 5-10% reduksjon i aktivitet etter 72 timer 12. Som sådan kan utveksle medium før start av en farmakologisk eller genetisk utfordring til ER kalsiumhomeostase være nødvendig å redusere bakgrunnssignal på grunn av opphopning sensor. I motsetning til dette, var halveringstiden for Gluc-SERCAMP in vivo er 3.5 til 4.7 min 12 indikerer signalet i plasma representerer en siste utgaven av reporter inn i sirkulerende blod. Når blodet er ex vivo og bearbeidet til plasma, men er Gluc-SERCaMP meget stabil (figur 5).
For de metoder som er beskrevet, er mediet eller plasma overført til ugjennomsiktige 96-brønners plater før enzymatiske analyser. To viktige faktorer å vurdere når du bruker Gluc-baserte reporters er enzym blits kinetikk og nedbryting av coelenterazine underlaget. Plate lesere utstyrt med injektorer er best egnet for å kjøre Gluc enzymatiske metoder for å normalisere tiden mellom underlaget tillegg og luminescens målinger. De kjemiske egenskapene til coelenterazine gjør det utsatt for forfall, noe som utelukker sammenligne rå luminescens verdier målt på ulike tidspunkter etter forbehandling. Brett forskjeller mellom prøvene blir imidlertid opprettholdt (figur 6), slik at den relative forskjell mellom kontroll og forsøksprøver som skal spores over varigheten av forsøkene (figur 9).
Evnen til å overvåke ER kalsium svingninger in vivo er fordelaktig når undersøke progressive sykdommer. Mens andre metoder, slik som fluorescerende fargestoffer cytoplasmatiske, er egnet for akutt in vitro-studier, er en SERCaMP reporter den første for å tillate langsgående ER kalsium overvåking. Our protokollen skisserer direkte lever injeksjoner av AAV-Gluc-SERCaMP. Vi har oppdaget jevn nivåer av Gluc-SERCaMP i sirkulasjon av uimotsagt dyr for 56 dager etter injeksjon (siste endepunktet testet så langt) og forutsi lengre eksperimenter er mulig 12. AAV vektorer er små i størrelse, måler ca 20 nm i diameter, og utgjør minimal biologisk krav 19. For å omgå omdannelsen av AAV enkelt-trådet genom til dobbeltkjedet DNA, ble AAV-SERCaMP pakket som en AAV-serotype en dobbeltkjedet vektor 20. AAV serotype-1 har blitt vist å effektivt omsette rottelever 19,21; derimot, er det forbeholdet av vår injeksjonsteknikk potensialet for viruset for å reise til andre vev i hele kroppen. Selv om vektoren ble direkte injisert inn i leveren, kan om fremgangsmåten som presenteres ikke skjelne kilden SERCaMP frigjøring, og derfor er det mulig at andre enn leveren vev kan bidra til Gluc-SERCamp signal. Fremtidige genetiske manipulasjoner vil begrense uttrykket å målrette vevstyper. For eksempel vevsspesifikke Grobunn driver linjer krysset med en Cre-avhengige Gluc-SERCaMP vil tillate for vevsspesifikt overvåking av ER kalsium via plasma prøvetaking.
Den beskrevne in vivo teknikken bruker lave virale titere på grunn av den robuste naturen av reporteren. Gluc-SERCaMP frigjøring kan detekteres fra en viral området 7,6 x 10 7 vg til 7,6 x 10 9 vg (figur 4). Denne serien er 4-400 ganger lavere enn rapportert i tidligere arbeider utnytte ildflueluciferase baserte virale injeksjoner av leveren 19. Ved høyere konsentrasjoner, ble det observert et tap av påvisbar ekspresjon over tid, noe som er mulig på grunn av en immunrespons i dyret til 22 transgenet. Høyere titere av virus bør unngås når det er mulig på grunn av økt sannsynlighet for signaltap. Lavere titers enn de presenteres ikke væreno testet. Denne protokollen skisserer injeksjoner av AAV-Gluc-SERCaMP i leveren; lignende tilnærminger er i teorien mulig for andre typer vev. Parametere som for eksempel viruskonsentrasjon og serotype må optimaliseres for tilstrekkelig ekspresjon i andre vev.
På grunn av den robuste natur reporter, kan små mengder blod (100-150 mL) hentes fra halen utklipp, noe som åpner for gjentatte samlinger gjennom eksperimenter. Dette var nyttig for lengde karakterisering av Gluc-SERCaMP utgivelse som svar på thapsigargin, hvor vi observerte forhøyede nivåer etter thapsigargin administrasjon fulgt av en tilbakevending til utgangsnivåer (figur 4). Riktig håndtering av plasmaprøvene følgende blodprøvetaking er også viktig. Som sådan, har vi vist at SERCaMP er stabilt i plasma oppbevares ved 4 ° C opp til 72 timer før enzymatisk analyse (figur 5). Videre kan plasmaprøver gjennomgå minst tre fryse / tHaw sykluser med minimal effekt på luminescens (figur 5). I praksis har vi lagre alle prøver ved -80 ° C, unngår unødvendige fryse-tine-sykluser før vurdering av enzymatisk analyse, og analysere alle prøvene for et eksperiment på samme tid.
ER kalsiummangel er implisert i patogenesen av en rekke sykdommer. Det er ofte antatt å være en oppstrøms hendelse som hindrer cellefunksjoner og fører til aktivering av den ufoldede protein respons (UPR). UPR er en adaptiv respons ansatt av ER å reetablere homeostatiske forhold 5. Kroniske tilstander av ER stress overskride kapasiteten til å gjenopprette UPR homeostase, til syvende og sist fører til celledød. ER stress og ER kalsium feilregulering er observert i sykdommer som type 1 diabetes, diabetisk nefropati, nevrodegenerative sykdommer og hjerte dieases 5. Forholdet mellom kalsium dysregulering og patogenese sykdom, er imidlertid difficult å avgrense. Den SERCaMP teknologien har potensial til å spore denne prosessen over levetiden for et dyr, og dermed gi innsikt i sykdomsutvikling og progresjon. Videre evaluering av potensielle terapeutiske midler for å hindre eller korrigere ER kalsium dysregulering kan evalueres gjennom bruk av SERCaMP. Til slutt, identifisere sykdommer hvor Gluc-SERCaMP frigivelse oppstår tilbyr muligheten til å konstruere og anvende utskilte terapeutiske proteiner eller peptider som SERCaMPs som et middel for sykdom regulert genterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | Fisher | 02-682-550 | |
| 10% NP-40 solution | Pierce | 28324 | for intracellular GLuc assays |
| 1 ml luer-lok syringes | Fisher | 14-823-30 | |
| 200 microliter filter tips | Rainin | RT-L200F | |
| 3-0 surgical sutures | Fisher | NC9598192 | |
| 30 G needles | Fisher Scientific | 14-821-13A | |
| Adhesive microplate sealing sheets | Thermo | AB-0558 | |
| Alcohol prep pads | Fisher | 22-246-073 | |
| Anesthesia Auto Flow System | E-Z Anesthesia | EZ-AF9000 | |
| Animal recovery chamber | Lyon Vet | ICU-912-004 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Betadine solution | Fisher | NC9386574 | |
| Bleach | Clorox | n/a | |
| Bovine growth serum | Thermo | SH30541.03 | |
| Coelenterazine, Native | Regis Technologies | 1-361204-200 | |
| Cotton tipped applicators | Puritan | 806-WC | |
| Cutting needles 3/8 circle sutures | WPI | 501803 | |
| Digital ultrasconic cleaner | Fisher Scientific | FS60D | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate | Life Technologies | 10569-010 | |
| DNA mass ladder | Life Technologies | 10496-016 | |
| Gaussia luciferase (recombinant protein) | Nanolight | 321-100 | |
| Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC) | New England Biolabs | E8023S | 1:2,000 (WB) |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | DS-401 | |
| Gluc assay plates (96 well, opaque) | Fisher | 07-200-589 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14175-095 | |
| Heparin | Allmedtech | 63323-276-02 | |
| Isoflurane | Butler Schein | 29404 | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Kwik Stop Styptic powder | Butler Schein | 5867 | |
| L-glutamine | Sigma | G8540 | |
| Methanol | Fisher | a452-4 | |
| Microfuge 22R Centrifuge | Bekman Colter | 368831 | |
| Neosporin | Fisher | 19-898-143 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nikon Stereoscope | Nikon | SMZ745T | |
| Nucleospin Gel and PCR Cleanup | Machery-Nagel | 740609 | |
| P200 pipet | Rainin | L-200XLS+ | |
| p24 Lenti-X rapid titer kit | Clontech | 632200 | |
| PCR film seal | Fisher | AB0558 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| ReFresh Charcoal Filter canister | E-Z Anesthesia | EZ-258 | |
| Scalpel blades, #10 | Fine Science tools Inc | 10010-00 | |
| SD rats 150-200 g | Charles River | Rats | rats ordered at 150-200 g. Surgery 5 days after arrival |
| Small animal ear tags | National Band and Tag co | 1005-1 | |
| Sterile surgical drapes | Braintree Scientific | SP-MPS | |
| Synergy 2 plate reader | BioTek | n/a | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | harmful to human health |
| Virapower lentiviral packaging mix | Life Technologies | K4975-00 | |
| Xfect Transfection reagent | Clontech | 631318 | |
| Xylazine | Valley Vet | 468RX |
References
- Sitia, R., Braakman, I. Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory. Nature. 426 (6968), 891-894 (2003).
- Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38 (3-4), 303-310 (2005).
- Fu, S., et al. Aberrant lipid metabolism disrupts calcium homeostasis causing liver endoplasmic reticulum stress in obesity. Nature. 473 (7348), 528-531 (2011).
- Micaroni, M. The role of calcium in intracellular trafficking. Curr Mol Med. 10 (8), 763-773 (2010).
- Mekahli, D., Bultynck, G., Parys, J. B., De Smedt, H., Missiaen, L. Endoplasmic-reticulum calcium depletion and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (6), (2011).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
- Whitaker, M. Genetically encoded probes for measurement of intracellular calcium. Methods Cell Biol. 99, 153-182 (2010).
- Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
- Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153 (2014).
- Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44 (4), 386-399 (2008).
- Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Richie, C. T., Harvey, B. K. SERCaMP: a carboxy-terminal protein modification that enables monitoring of ER calcium homeostasis. Mol Biol Cell. 25 (18), 2828-2839 (2014).
- Henderson, M. J., Richie, C. T., Airavaara, M., Wang, Y., Harvey, B. K. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) secretion and cell surface binding are modulated by KDEL receptors. J Biol Chem. 288 (6), 4209-4225 (2013).
- Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proc Soc Exp Biol Med. 130 (1), 305-310 (1969).
- Zigler, J. S., Lepe-Zuniga, J. L., Vistica, B., Gery, I. Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium. In Vitro Cell Dev Biol. 21 (5), 282-287 (1985).
- Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro. Virology. 372 (1), 24-34 (2008).
- Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin. Thromb Haemost. 70 (6), 1024-1029 (1993).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (4), 582-591 (2009).
- Sobrevals, L., et al. AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers. Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).
- Wang, Z., et al. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).
- Seppen, J., et al. Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats. Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).
- Hareendran, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them. Rev Med Virol. 23 (6), 399-413 (2013).
