Abstract
Эндоплазматическая сеть (ЭР) содержит высокий уровень внутриклеточного кальция, с концентрацией примерно 5000 раз больше, чем цитоплазматических уровней. Жесткий контроль над ER кальция необходимо для сворачивания белка, модификации и торговли людьми. Возмущение в ER кальция может привести к активации разложенном ответ белка, тройного механизма в ответ ER стресс и способствуют патогенезу в различных заболеваний. Возможность отслеживать изменения ЭР кальция во время начала заболевания и прогрессирования принципиально важно, но сложно на практике. В настоящее время доступны методы мониторинга ER кальция, такие как кальций-зависимых флуоресцентных красителей и белков, предоставили понимание динамики ЭР кальция в клетках, однако эти инструменты не подходят для исследований в естественных условиях. Наша лаборатория продемонстрировала, что модификация карбокси-конца Gaussia люциферазы дает секрецию репортера в ответ наЭР истощение кальция. Методы с использованием люциферазы основе, секретируемый белок ЭР мониторинг кальция (SERCaMP) для ин витро и ин виво приложений описаны здесь. Это видео подчеркивается печени инъекции, фармакологической манипуляции Gluc-SERCaMP, сбора и обработки крови и параметры анализа для продольной мониторинга ER кальция.
Introduction
Эндоплазматическая сеть (ER), функции во многих клеточных мощностей в том числе сворачивания белка, секреции белка, липидов гомеостаза, и внутриклеточная сигнализация 1. Центральное место в нормальной функции ER является поддержание просвета концентрации кальция на ~ 5000 раз те нашли в цитоплазме 2-4. Этот интенсивный энергетический процесс регулируется АТФ-азы Сарко / эндоплазматическая сеть кальция (SERCA), насос, который перемещает ионы кальция в ER. Истечение кальция из ER опосредовано главным образом Рианодин (RyR) и инозитолтрифосфата (IP3R) рецепторов. Потому что многие процессы ER зависит от кальция, нарушая магазин может привести к ER стресса и возможной смерти клеток.
ЭР нарушение регуляции кальция наблюдается при заболеваниях, включая кардиомиопатия, диабет, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и 5. Благодаря прогрессивной природы этих заболеваний, она была сложной, чтобы очертить причинно-следственную Reвисимостью между патогенеза и изменений в магазине ER кальция. Ряд технологий позволили значительные успехи в нашем понимании динамики ЭР кальция, в том числе красителей и генетически кодируемых показателей кальция (GECIs). Низкое сродство красители кальция, который увеличение флуоресценции при связывании с Ca 2+, могут быть загружены в клетках изучить субклеточных компартментах с высокими концентрациями кальция 6. GECIs, такие как D1ER и ловец позволяют для мониторинга колебаний кальция с более точным контролем субклеточном локализации 7-9. Недавно другой класс GECIs называемые кальциевые измерения органелл захваченных показатели белка (Cepia) были описаны 10. Третий подход, сочетающий генетики и химии малая молекула является мишенью-эстеразы краситель нагрузка (TED), который использует генетически закодированный карбоксилэстеразы (ориентированы на ER) с эфира на основе красителя кальция 11.
В то время как A дляementioned подходы присущи сильные и слабые стороны, они могут предоставить ценную информацию в динамике кальция ER через острых измерений флуоресценции. Они, однако, не является оптимальным для продольных исследований часто, необходимых для расследования прогрессирование заболевания. С целью разработки способа контролировать динамику кальция в течение длительного периода времени, мы определили и разработали модификацию белка для создания белков, секретируемых ER кальция мониторинга (SERCaMPs) 12.
SERCaMP обходит несколько ограничений, связанных с другими методиками, обеспечивая минимально инвазивной подход многократно опросить магазин ЭР кальция. Ранее нами было показано, что карбокси-концевой пептид ASARTDL (аланин-серин-аланин-аргинин-треонин-аспарагиновой кислоты-лейцин) достаточно для содействия сохранению ER; Однако, в условиях, которые вызывают снижение в ЭР кальция, последовательность пептида больше не в состоянии сохранить ER localizatioп и белок секретируется 13. Основой технологии является SERCaMP придатком ASARTDL к карбокси-конца секретируемого белка (например, Gaussia люциферазы, или Gluc), что секреция вызвано истощением ER кальция, тем самым создавая надежную корреспонденту ER нарушения регуляции кальция 12. Выражение Gluc-SERCaMP помощью трансгенных методов позволяет биологических жидкостей, включая среду для культивирования клеток и плазмы анализируемого изменений в Gluc деятельности как индикатор гомеостаза ER кальция. Метод имеет приложения для продольного исследования прогрессивных изменений в ER магазине кальция в пробирке и в естественных условиях. Следующий протокол записывается в виде общих чертах для использования Gluc основе SERCaMP учиться ER гомеостаз кальция, но протокол может служить в качестве руководства для альтернативных репортеров SERCaMPs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. In Vitro анализе: Обнаружение SERCaMP выпуска из клеточной линии Стабильный SH-SY5Y
- Пластина SH-SY5Y-Gluc-ASARTDL (SERCaMP) в тканевой культуре обрабатывают пластин при 150000 клеток на см 2 площади поверхности. Для 96-луночных планшетах, например, семена 50000 клеток на лунку (фиг.1А). Растут SH-SY5Y, в DMEM (высокая глюкоза, GlutaMAX, пируват) + 10% роста бычьего сывороточного + 1x пенициллина / стрептомицина.
- Прохождение клетки до 15 раз (рис. 1В) Большее число проход не был протестирован.
- Возврат клетки увлажненном инкубаторе при 37 ° С с 5,5% CO 2 и инкубировать в течение ночи.
- Перед экспериментальной обработкой (ов), собирают базовый образец для каждой лунки путем передачи 5 мкл супернатанта культуры с непрозрачной стеной 96-луночный планшет. Перед сбором, мягко постучите по планшету со всех сторон и водоворот, чтобы избежать градиентные эффекты. Уплотнение непрозрачную пластину с клейкой сИлинга лист и хранят при температуре 4 ° С до времени ферментативного анализа.
Примечание: секретируемый Gluc-SERCaMP очень стабилен в среду для культивирования клеток. Ранее сообщалось примерно 5-10% Gluc активности было потеряно после 72 ч инкубации при 37 ° C (инкубируют на SH-SY5Y, 12). - Лечить клетки, как желательно, чтобы изучить истощение кальция ER (например, экологические, фармакологического, генетические манипуляции). Избегать длительного воздействия окружающей среды (за пределами контролируемой инкубаторе) в качестве изменения рН будет происходить быстро при атмосферном CO 2. Добавить HEPES к культуральной среде при 20 мМ, рН для стабилизации 14, если требуются длительные манипуляции. Избегайте воздействия света при использовании HEPES в культуральной среде 15.
- Положительный контроль: Лечить клеток с 100 нМ тапсигаргин (ТГ) или 50 мкМ cyclopiazonic кислоты (CPA) в течение 4-6 ч для экспериментов в SH-SY5Y клеток. Максимальный отклик в других клеточных линий может требовать более длительного инкубации или различными концентрациях соединений.
- Отрицательный контроль: Сбор культуры из родительских SH-SY5Y клеток. По нашему опыту, фон свечения для этого анализа составляет менее 0,05% от базисной секреции стабильных клеток SH-SY5Y-Gluc-SERCaMP.
- Сбор и образцы магазин 5 мкл кондиционированной среды в требуемых временных точках, как описано в шаге 1.2.
- Оценка ферментативной активности в среде, как описано в разделе 5.
- Изучите внутриклеточный Gluc по иммуноблот или люминесценции анализа.
- Для иммуноблот: лизировать клетки в буфере RIPA модифицированной, содержащем 50 мМ Трис (рН 7,4), 150 мМ NaCl, 0,25% дезоксихолат натрия, 1 мМ ЭДТА, 1% NP40 и ингибиторы протеаз. Отдельные на SDS-полиакриламидном геле и передачи 0,20 мкм PVDF мембрану. Инкубируйте мембраны с Gluc антитела (1: 2000 разведение) ночи при 4 ° С. Выполните вторичные антитела инкубации и мембранные моет согласно протоколу определяемых пользователем для обнаружения реагента выбора.
- Длялюминесценции анализ (рис 2): выполните следующие действия на льду:
- Удалить все среды из скважин планшета для культуры ткани и промыть 200 мкл холодного PBS.
- Добавить 75 мкл буфера для лизиса, содержащего 50 мМ Трис (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 1% NP40 и ингибиторы протеаз в каждую лунку.
- Поверните пластину на орбитальном шейкере (120 оборотов в минуту) при 4 ° С в течение 20 мин.
- Аккуратно пипетки лизат вверх и вниз с помощью многоканальной пипетки, избегая пузырьков воздуха. Перевести 5 мкл лизата с непрозрачной пластины и оценить свечение, как указано в разделе 5.
2. Экстракорпоральное анализе: Переходные Трансфекцию иммортализованных клеток с SERCaMP
Примечание: Мы заметили, что переходные процедуры трансфекции может вызвать клеточный стресс и тупой ответ последующее Gluc-SERCaMP. Следующий подход был разработан, чтобы минимизировать трансфекции эфф ECTS в SH-SY5Y клеток. Оптимизация этой процедуры (включая выбор реагента для трансфекции) для альтернативных клеточных линий может потребоваться. Когда это возможно, рекомендуется использовать устойчивые клеточные линии или вирусными методы трансдукции, изложенные в разделах 1 и 3 соответственно.
- Пластинчатые SH-SY5Y клетки в 100 мм блюдо на 4 х 10 6 клеток. Это блюдо будет достаточно, чтобы вновь семян около 300 скважин (96 формата также пластины) следующие процедуры трансфекции.
- Трансфекции клеток с использованием реактива Xfect 20 мкг плазмидной ДНК (кодирующей Gluc-SERCaMP) и 6 мкл реагента. Xfect Масштаб ДНК и Xfect реагент, соответственно, для больших или меньших сосудов для культивирования.
- Вернуться клетки инкубатора в течение 48 часов.
- Trypsinize клеток и повторное заполнение в 96-луночные планшеты при 60000 клеток на лунку. Следуйте последующие шаги, описанные в разделе 1.
3. In Vitro анализе: вирусный вектор-опосредованной Выражение Gluc-SERCaMP
палатка "> Примечание: аденоассоциированные вирусной (AAV) вектора упаковка 16 и 12 и очистки лентивирус производство 13 были ранее.- Титр Gluc-SERCaMP AAV с помощью следующих праймеров и зондов: прямой праймер, 5'-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3 '; Обратный праймер, 5'-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3 '; Зонд (5'-6-FAM / 3'-BHQ-1 помечены), 5'-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 'для количественной ПЦР.
- Подготовьте стандартный кривой линеаризуя плазмиды, содержащей Gluc и очистки ДНК, используя спин-колонку (например Machery-Нагель NucleoSpin гель и ПЦР очистки). Количественного определения ДНК, отделяя на агарозном геле вместе массового лестницы. Приготовьте 1:10 разбавление ДНК из 100 пг / мл до 10 мкг / мл в PBS. Расчет копий / мл Gluc плазмидной ДНК в каждой из концентраций, основанных на молекулярной массе плазмиды.
- Развести акции AAV в PBS (соответствующее разведение будет зависеть отПараметры вирусного препарата и определяется опытным путем).
- Запуск реакции ПЦР в режиме реального времени системы ПЦР с использованием следующих условий: 95 ° C × 5 мин, 94 ° С × 20 сек, и 60 ° С × 1 мин в течение 41 циклов. Рассчитать копии / мл с использованием стандартной кривой.
- Титр лентивирус с р24 Ленти-X быстрого набора титра. Оттепель лентивирусные аликвот на льду и разбавить управления белка р24 в SH-SY5Y среды.
- Развести лентивирус таким образом, что она будет падать на стандартной кривой (например, 1: 20000 или 1: 100000). Коэффициент разбавления требуется будет варьироваться в зависимости от параметров лентивирусных подготовки и должно быть определено опытным путем. Следуйте инструкциям производителя для всех последующих шагов.
- Пластина клеток в 96-луночных планшетах. Для SH-SY5Y, процедуры обшивки, изложенные в разделе 1, можно следовать. Для крыс первичных корковых нейронов, клетки должны быть изолированы и высевают на пластины, покрытые соответствующимс ранее описано 16. Поддержание крыс первичные корковых нейронов в Neurobasal среде с добавлением 1x B27 и 500 мкМ L-глутамина. Выполните половиной обменов среднего каждый день.
- Трансдукции клеток с вирусом. Цель вирусный трансдукции является достижение выражение низкого уровня, а Gaussia люциферазы обеспечивает надежную сигнал.
- AAV трансдукции SH-SY5Y клетки: трансдукции на следующий день после посева. Развести AAV до 6,0 х 10 7 VG / мкл в разбавления AAV буфера (PBS + 0,5 мМ MgCl 2). Добавьте 5 мкл разбавленного AAV (3,0 х 10 8 В.; МВД приблизительно 6000) на лунку 96-луночного планшета (рис 3А). Используйте 10% отбеливатель для инактивации вирусного вектора отходов.
- AAV трансдукции крыс первичных корковых нейронов: преобразовывать 6-8 дней после посева. Развести AAV до 4,0 х 10 6 В.Г. / мкл в буфере для разведения AAV. Добавьте 5 мкл разбавленного AAV (2,0 х 10 7 В.; МВД приблизительно 350) в лунку96-луночный планшет (3В). Оптимальное МВД должны быть определены эмпирически для других типов клеток. Используйте 10% отбеливатель для инактивации вирусного вектора отходов.
- Лентивирусов трансдукция SH-SY5Y ячеек: трансдукции на следующий день после посева. Развести лентивирус 20 пг / мкл p24 (концентрация определяется с помощью титрование комплект) в сбалансированном солевом растворе Хэнкса. Добавить 5 мкл разбавленного вируса на лунку (100 мкг p24, эквивалентна 1.250.000 лентивирусов частиц, или ~ 1250 IFUs) из 96-луночного планшета, содержащего 100 мкл объем. Масштаб, соответственно, для больших форматов. Используйте 10% отбеливатель для инактивации вирусной отходов.
- Сбор предварительной обработки образца среды и начать Экспериментальное лечение 48 ч (SH-SY5Y) или 5-7 дней (крысы первичных корковых нейронов) после трансдукции.
4. В Vivo SERCaMP анализе
Примечание: Перед проведением любых процедурах животных быть уверены, чтобы получить правильную одобрение через учреждения. Всеоперации выживания должно быть сделано в стерильных условиях с адекватной анестезии. Все процедуры, описанные ниже, были утверждены и находятся в соответствии с руководящими принципами NIH ACUC.
- Автоклав хирургические инструменты до начала операции (121 ° С, 30 мин стерилизации, 20 мин время высыхания). Очистите все инструменты в ультразвукового дезинтегратора сразу же после всех процедур и перед автоклавированием. Поддержание стерильных условий во время операции выживания. Для операций, требующих нескольких животных, протрите хирургических инструментов с 70% -ным спиртом, ultrasonicate и шарик стерилизации между крысами. Обратитесь к Список материалов для необходимых инструментов.
- Подготовка к операции крысу. Здесь мы используем мужчина Спрэг Dawley (180-200 г).
- Обезболить крысах с использованием газа изофлуран в течение 3 мин (4-5% изофлуран доставляется при 1000 куб.см / мин) с последующим внутрибрюшинных инъекций ксилазина (8 мг / кг) и кетамина (80 мг / кг). Применить глазной мази для защиты роговицы от высыхания. ВEgin хирургия когда-то крысы глубоко под наркозом, как показано отсутствием вывода рефлекса следующей хвост или ноги крайнем случае.
- Бритье область живота чуть ниже ребер (низкий грудной области) в середине брюшной полости. Скраб хирургической области три раза, чередуя 70% спирта и Betadine скраба. Поместите крысу в положении лежа на спине на стерильный хирургический участок с стерильных хирургических салфеток.
- Развести AAV-Gluc-SERCaMP 7,6 х 10 9 В. / мл (конечная концентрация). Все хорошо перемешать путем обращения трубку.
Примечание: Диапазон концентрации вируса может варьироваться (рисунок 4).- Внесите 105 мкл разбавленного AAV в стерильную чашку. Использование 30-иглы для сбора вируса в шприц.
- Выполните операцию по разоблачению печень и придать AAV-Gluc-SERCaMP.
- До принятия разрез в брюшной полости, применяются 0,25% бупивакаин в области разреза. Использование скальпеля, сделать горизонтальную разрез ниже грудной клетки (APзительно 2-3 см). Блант рассекать отделить соединительную ткань гиподермы от.
- Вырезать брюшной мышцы, обнажая правую медиальной доли печени.
Примечание: дополнительные лепестки могут быть введены на основании конечного применения. - Поместите животное под операционным микроскопом и настроить, чтобы получить правильный медиальной доли печени в поле зрения. Внедрить вирус в паренхиме медиальной доли; 3 отдельные участки, примерно 33 мкл на сайте.
Примечание: Оставьте иглу в ткани на 5-10 сек после инъекции, чтобы обеспечить доставку всего объема впрыска. - Шовный брюшной мышцы и кожу отдельно и добавить Neosporin помощью ватной палочки. Поместите крысу в камеру регенерации до сознания не восстановили и крысы в состоянии поддерживать вертикальное положение. Не оставляйте крысу (ы) без присмотра, пока он не восстановил достаточную сознание поддерживать грудины лежачее положение. Дом в одиночку, пока разрез зажила и швы были удалены (7-14 дней).
- Начало хвост сбора крови 4-7 дней после инъекции. Подготовка сбора крови труб путем маркировки и предварительно взвешивания. Добавить 50 мкл гепарина (1000 ед / мл) в каждую пробирку.
- Место крысы в ИФ анестезии камеры в течение 3 мин (4-5% Isoflurane поставляемого в 1000 куб.см / мин). Удалить крысу из камеры и места в носовой конус (2-3% Isoflurane поставляемого в 500 куб.см / мин). Сбор крови может начаться после того, как крыса глубоко под наркозом, как показано отсутствием вывода рефлекса после хвост пиNCH.
- Использование стерильных ножниц вырезать кончиком хвоста (1-2 мм) и собрать кровь по каплям в предварительно заполненный гепарина трубки. Соберите кровь, пока объем не достигнет больше, чем 2: 1 соотношение кровь гепарин (> 100 мкл крови / мкл гепарина 50). Объемы сбора крови может быть скорректирован на основе эксперимента. Используйте влажную хлопчатобумажную аппликатор, чтобы применить кровоостанавливающим порошок в хвост, чтобы остановить кровотечение.
- Трубки хранения крови при 4 ° С, если собирать последующие образцы. Протрите ножницы с этанолом площадку и шарик стерилизовать между коллекциями.
- Взвесьте сбора трубы и отрегулируйте с гепарином, чтобы получить 2: 1 соотношение (кровь: гепарин). Этот шаг нормализовать количество гепарина в каждой пробе (таблица 1).
- Пробирки центрифужные при 2000 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Перенесите супернатант (плазмы) в чистую пробирку и хранить при температуре -80 ° С до момента анализа люциферазы (раздел 5).
Примечание: Хранение образцов при 4 ° С до 72 ч до анализа ферментативной имеет тinimal влияние на люминесценции (рис 5А). До 3 замораживания-оттаивания цикла образцов плазмы не оказывают никакого влияния на люминесценции (рис 5B).
- Тапсигаргин администрация (положительный контроль):
- Подготовьте тапсигаргин разбавлением в этаноле до конечной концентрации 2,5 мг / мл. Вводите тапсигаргин на 1 мг / кг внутрибрюшинно в нижней части живота.
Примечание: тапсигаргин увеличивает тромбина-индуцированной тромбоцитов коагуляция 17 и может сделать забор крови из хвоста более сложной.
- Подготовьте тапсигаргин разбавлением в этаноле до конечной концентрации 2,5 мг / мл. Вводите тапсигаргин на 1 мг / кг внутрибрюшинно в нижней части живота.
- Gaussia люциферазы анализа:
- Оттепель образцы плазмы на льду.
Примечание: Для продольных исследований, оттепели и выполнять люминесценции анализа для всех образцов временной точке в тот же день (с помощью одного препарата субстрата). - Передача 10 мкл плазмы непрозрачной стеной пластины и измерить ферментативную активность, как описано в разделе 5. Выполнить 3-4 повторов технические каждого образца плазмы.
- Оттепель образцы плазмы на льду.
- Euthanasi
Примечание: Преимущество технологии SERCaMP является возможность продольно-монитор ER кальция. В зависимости от параметров эксперимента и конечной анализирует, животные должны быть умерщвлены с помощью мер, подходящих для конечной анализирует и в соответствии с ведомственным руководящим принципам ACUC.
5. Люминесценция Анализ
- Подготовьте коэлентеразин (CTZ) растворы путем разбавления соединения в подкисленный метанол (30 мкл 10 н HCl до 3 мл метанола) до 20 мм. Подготовьте отдельные аликвоты использовать и хранить при температуре -80 ° C.
- Подготовьте рабочую подложку в день анализа.
- Для анализов в пробирке, разбавленных коэлентеразином до 8 мкм в PBS, например, добавить 10 мкл 20 мМ CTZ складе 25 мл PBS (фиг.6А, В).
- Для анализов в естественных условиях, разбавленные коэлентеразином до 100 мкм в PBS, 500 мМ аскорбиновой кислоты, 5 мМ NaCl.
- Выдержите подготовленную ЧТЗ, по крайней мере 30 минпри комнатной температуре до начала анализа.
Примечание: Этот шаг часто входит в Gaussia люциферазных анализов, поскольку есть сообщения о быстрого распада субстрата во время первых 30 мин после приготовления. Мы не наблюдали этот эффект в нашей системе (рис 6C); Однако, мы часто включают в себя стадию инкубации, как мы не нашли никакого отрицательного влияния на анализ. - Использование планшет-ридера, который способен мониторинга биолюминесценции и оснащен подложки инжектора. Премьер линии с подложкой.
Примечание: Исходный субстрат через линии могут быть склонны к деградации. Чтобы избежать искусственно низкие показания для начала образцов, вводят 20-30 пустые колодцы (Загрузка пустую тарелку на читателя) до измерения экспериментальных образцов. - Вводите 100 мкл субстрата в хорошо встряхните среднюю скорость в течение 5 сек, и измерить излучение света. Для читателя пластины Биотек Синергия II, интегрировать излучение света над 0,5 сек (образцы в пробирке) и 5 сек (вVIVO образцов) для стадии чтения. Оптимизация параметров ридере для идеального проведения анализа.
Примечание: Gaussia люциферазные экспонаты флеш кинетика с быстрым распадом сигнала (по сравнению с светиться кинетики наблюдаемые с другими люцифераз). Вспышка кинетика Gluc влияют сыворотки в клеточной культуральной среде (рис 7А), подчеркивая важность контроля за состава среды через образцов. Из-за быстрого распада люминесценции после добавления субстрата (флеш кинетики), время между внедрить и прочитайте шаги должны быть едиными для всех образцов. Читатель пластина должна быть установлена, чтобы придать подложки хорошо, подождите определенное время (например, мы используем дрожания шаг 5 сек), и читать, что хорошо. Добавление подложки ко всему пластины перед чтением представляет собой значительную проблему, если субстрат не может быть добавлен во все лунки одновременно. Если инжектор не доступен, проблема может быть частично обойдена путем инкубации тарелку в течение 10 мин между подложкой дополниния и измерения (при этом избегая крутой части кривой затухания) (рис 7б). - Повторите инъекции, время ожидания, и прочитайте шаги для каждого колодца на тарелку.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Метод Gluc-SERCaMP позволяет для оценки ER кальциевого гомеостаза путем отбора проб внеклеточной жидкости. Несколько элементов управления могут быть включены в экспериментальной конструкции до повышения интерпретацию результатов. Во-первых, использование конститутивно секретируемый репортера (например Gluc без С-концевого ASARTDL или "Gluc-тега") может быть использован для оценки влияния экспериментальных процедур на секреторный путь (глобальная сотовая секреции) и экспрессии трансгена. Например, увеличение внеклеточного уровня как Gluc-SERCaMP и Gluc-нет этикеток будет считаться неоднозначный результат. Кроме того, увеличение секреции Gluc-SERCaMP с соответствующим недостатком Gluc-Нет ответа Tag поддерживает ER кальция в зависимости событие (рисунок 8). Секреция Gluc-SERCaMP в ответ на истощение ER кальция может быть дополнительно оценена посредством измерения внутриклеточной Gluc, хотя это ограничивается одним временной точке, как это требуется для лизиса. Int racellular Gluc-SERCaMP снизится в ответ на истощение ER кальция, как это постепенно секретируемых и внеклеточный: внутриклеточного отношение (рассчитывается для каждого отдельного лунку) увеличится (Фигура 2В). Внеклеточный: Отношение внутриклеточной полезно для контроля изменений в экспрессии трансгена.
Фармакологические модуляторы ЭР магазине кальция могут быть использованы для подтверждения вклад ER кальция в SERCaMP выпуска в новых парадигмах. Дантролен, антагонист RyR, как известно, стабилизирует ER кальций, который должен уменьшить или ингибировать высвобождение SERCaMP в ответ на Tg (8В). Рекомендуется, если это возможно, чтобы проверить дополнительные соединения, которые влияют на поток кальция ER (например Xestospongin C, 4-хлор-м-крезол) в новых экспериментальных парадигм, использующих SERCaMP. Эти исследования часто вызов в естественных условиях, но может быть возможным в соответствующих моделей культуры ткани.
"> Для исследований ин витро с использованием Gluc основе SERCaMP, рекомендуется, чтобы вычислить ответы на отдельные пластины по отношению к контролю (ов). По 'лечение индуцированной' ответ может быть оценена по timecourse путем отслеживания изменений в относительной реакции в сравнении с контролем ( для между-пластины сравнений). Это не целесообразно сравнить исходные цифры по нескольким пластин, благодаря распаду подложки, которые могут привести к изменениям в исходных значений между временных точках (рис 6в). Создание относительных сравнений в тарелку минимизирует этот эффект (рис 6D). Пример анализа данных для экстракорпорального ТГ-индуцированной релиз эксперимента в SERCaMP представлен на рисунке 9.Для исследований в естественных условиях с использованием Gluc-SERCaMP, данные должны быть оценены независимо для каждого животного, с каждого животного, выступающей в качестве ее собственного контроля "предварительной обработки". Это необходимо для учета изменчивости в трансген-дель-ivery и выражение между животными (рис 4а).
Величина ответов SERCaMP будет зависеть от множества факторов, многие из которых связаны с базовой здоровья клеток и может быть непосредственно контролируемых исследователем. Для максимального SERCaMP отзывчивость, необходимо оптимизировать условия, которые способствуют базальной гомеостаза ER кальция. Это включает в себя посев клеток на оптимальной плотности и использование низкие вирусные титры. Различные типы клеток и тканей может иметь дополнительные требования, которые должны быть определены опытным путем.
Рисунок 1:. Стабильный SH-SY5Y клеточной линии плотность посева и прохождение соображения номер (A) SH-SY5Y-Gluc-SERCaMP клетки высевали на различных плотностей и инкубировали в течение 40 ч. Секретируемый Gluc-SERCaMP измеряли 4 ч после обработки 300 нМ ТГ Оуправления R транспортного средства (средняя ± SD, п = 6). Тапсигаргин-индуцированной секреции увеличение Gluc-SERCaMP показан для каждого плотности клеток. (B), SH-SY5Y-Gluc-SERCaMP клетки при прохождении номер 2 и 15 были рассмотрены на секрецию тапсигаргин-индуцированной. Клетки обрабатывали 100 нМ Tg в течение 2 ч или 4 ч, и секретируется Gluc активность была нормирована на обработанной носителем управления (среднее ± стандартное отклонение, n = 4, не оказывает существенного влияния на проход фактора, 2-дисперсионный анализ). Пунктирная линия указывает у = 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2:. Ферментативный анализ для измерения внутриклеточного Gluc-SERCaMP (А) Внутриклеточные и (Б) внеклеточного ферментативную активность Gluc оценивалась в крыс первичной корческие нейроны (трансдуцированные AAV-Gluc-SERCaMP). Через шесть дней после трансдукции, клетки обрабатывали 60 нМ тапсигаргин в течение 4 ч. Как Gluc-ASARTDL накапливается в среде, соответствующие уменьшается внутриклеточных уровней наблюдаются. (C) Соотношение внеклеточной: внутриклеточного Gluc деятельности могут быть рассчитаны для каждого колодца.
Рисунок 3:. AAV-Gluc-ASARTDL титр против тапсигаргин-индуцированной реакции для SH-SY5Y, и крысы первичных корковых нейронов (A) SH-SY5Y клетки высевали в 96-луночные планшеты при 5 х 10 4 клеток на лунку и дают возможность прилипать ночь. Клетки трансдуцированных с указанной множественностью заражения (MOI), инкубировали в течение 48 ч, а затем обрабатывают 300 нм Tg или транспортного средства. Люминесценции была измерена в среду после 8 часов (среднее ± SEM, п = 3). * Р <0,05, мулtiple т-тесты (Холм-Сидак коррекция). (Б) крыс первичные нейроны коры трансдуцировали на div8 с AAV-Gluc-ASARTDL по указанной МВД (рассчитанного с использованием 60000 клеток на приближении также во время трансдукции). Через пять дней после трансдукции, клетки обрабатывали 100 нМ Tg или управления транспортным средством и люминесценции в среде измеряли после 8 часов (среднее ± SEM, п = 6). * Р <0,05, несколько Т-тесты (Холм-Сидак коррекция).
Рисунок 4:. Тапсигаргин-индуцированной Gluc-SERCaMP высвобождение в кровь следующий внутрипеченочных инъекций более диапазоне титров вируса (А) необработанные величины люминесценции из крыс (N = 8) вводили внутрипеченочно с различными титрами AAV-Gluc-ASARTDL. Тапсигаргин (1 мг / кг) инъекции (внутрибрюшинно) вводили в день 12. Кровь собирали в указанные моменты времени, и хранили при -80 & #176; С до времени анализа. (Б) Нормированные значения люминесценции от панели А, демонстрирующие тапсигаргин-индуцированной реакции SERCaMP у крыс (N = 8), выражающее различные количества AAV-Gluc-ASARTDL.
Рисунок 5:. Транспортировка и хранение образцов Gluc-SERCaMP плазмы (в естественных) (А) Плазму собирали у крыс внутрипеченочно выражая Gluc-SERCaMP (N = 10), на аликвоты и хранили при -80 ° С до момента анализа. Трубы были удалены из -80 ° С и хранили при 4 ° С в течение указанных периодов времени перед измерением люминесценции (среднее ± стандартное отклонение). (Б) Эффект нескольких замораживания / таяния образцов плазмы на Gluc ферментативной активности. Образцы плазмы собирали из крыс внутрипеченочно экспрессирующих AAV-Gluc-SERCaMP (N = 10) подвергались указанного количествациклов замораживания-оттаивания и анализировали на люминесценции (среднее ± стандартное отклонение).
Рисунок 6:. Подготовка коэлентеразином субстрат для Gluc-SERCaMP анализов (А) Культуральную среду собирали из SH-SY5Y-Gluc-SERCaMP клеточных линий, обработанных 300 нм Tg (или управления транспортным средством) в течение 5 ч. Gluc активность в среде была оценена путем инъекции PBS + различные концентрации коэлентеразином (среднее ± стандартное отклонение, n = 6). (В) Люминесцентные значения с панели А были нормированы на автомобиль рассматриваться контроль на каждой концентрации субстрата оценивать тапсигаргин-индуцированной эффект. (С) Субстрат распада в течение нескольких часов. Люминесценции от известного количества рекомбинантного Gluc (0,1 нг или 0,02 нг) была измерена в течение нескольких часов после приготовления подложки (среднее ± стандартное отклонение, n = 4). (D) В то время как сырье для люминесценции рекомбинантногоGluc со временем уменьшается из-за субстрату распада, кратное различие в образцах (как определено люминесценции) была сохранена.
Рисунок 7:. Соображения для Gluc-SERCaMP анализов, связанных с кинетикой реакции Gluc / ЧТЗ (А) Культура средних изменяет распад сигнала Gluc / ЧТЗ. 5 мкл супернатанта, содержащего Gluc-SERCaMP смешивали с различными соотношениями PBS и культуральную среду. 100 мкл субстрата (15 мкМ CTZ в PBS + 500 мМ аскорбиновой кислоты) был добавлен к 50 мкл образца, который был разбавленных, как указано в таблице. Световое излучение контролировали в течение 15 мин. (Б) 5 мкл среды отбирали из SH-SY5Y-Gluc-ASARTDL клеток и 100 мкл субстрата (8 мкМ CTZ в PBS + 5 мМ NaCl) был добавлен. Свечение измеряется сразу после добавления субстрата (T = 0) и каждые 30 сек в течение в течение 15 мин (± SD, п = 12). Данные, построенные в виде процентов сигнала по отношению к предыдущему интервалу 30 сек, чтобы оценить скорость распада. На вставке показаны необработанные данные люминесценции.
Рисунок 8:. Фармакологическая подтверждение истощения ER кальция (А) Влияние 100 нМ тапсигаргин на секрецию Gluc исследовали на Gluc-ASARTDL и Gluc-никакого контроля Tag (средний ± SD, п = 6). (Б) Стабилизация ER кальция с дантролена (RyR антагониста) ингибирует индуцированную ТГ-SERCaMP освобождения. Клетки предварительно обрабатывали указанными концентрациями Дантролен в течение 30 мин или 16 ч перед добавлением 100 нМ тапсигаргин. Gluc активность в среде измеряли после 4 часов (среднее ± стандартное отклонение, n = 6).
99fig9.jpg "/>
Рисунок 9:. Мок представительные результаты для анализа Gluc-SERCaMP Обратите внимание на автомобиль, обработанные значения могут уменьшить между пластинами, из-за подложки срыв (в зависимости от интервала времени между чтением отдельных пластин). Для учета этого эффекта, эффект лечения конкретных вычисляется независимо для каждого планшета и это соотношение по сравнению всей пластины.
| Дата | Крыса | Труба Масса (мг) | Объем Гепарин (мл) | Плотность Гепарин (г / мл) | гепарин масса (мг) | Масса трубки + гепарин (мг) | Общая масса после сбора крови (мг) | Масса собранной крови (мг) | Плотность крови (мкг / мл) | Расчетное объем крови (ул) | Объем гепарина, необходимое для 2: 1 соотношение | мл гепарина дополнительную добавить, прежде чем спина |
| 01.01.15 | SD Мужской | 1135,9 | 50 | 1.117 | 55.83 | 1191,73 | 1317,70 | 125.97 | 1.05 | 119.97 | 59.98 | 9.98 |
Таблица 1:. Кровь коллекция таблице Пример сбора крови журнале для исследований SERCaMP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол подчеркивает в пробирке и в естественных условиях полезности Gluc-SERCaMP контролировать истощение ER кальция. Хотя модификации белков для создания SERCaMP появляется обобщить с другими репортеров белков 12, мы выбрали Gaussia люциферазы для прочной (200-1000 раз большей) биолюминесценции по сравнению с другими люцифераз 18. Покажем детектируемого тапсигаргин-индуцированной Gluc-SERCaMP высвобождение через 100-кратного диапазона доз вируса Gluc-SERCaMP доставлены первичной коры головного мозга крыс нейронов, SH-SY5Y, и печени крыс (фиг.3 и 4). Мы ранее описали поколение стабильно трансфицированных клеток, экспрессирующих линии Gluc-ASARTDL и продемонстрировал, что всего 20 клеток в популяции 5 х 10 4 клеток немеченых можете сообщить тапсигаргин индуцированный ответ 12. Здесь мы показываем, что стабильная клеточная линия может постоянно сообщают ТГ-индуцированной ответ из 15 отрывков, наиболее Analyzред, указывая, что непрерывное выражение репортера в течение долгого времени не повлиять на ее способность быть выпущен в ответ на истощение ER кальция (рис 1). Наши данные показывают, что Gluc-SERCaMP не в первую очередь проводится в ER клетки до времени истощения кальция ER, когда он секретируется. В "нормальных" условиях, существует низкая базальная секреция, что позволяет установить базовый ER кальциевого гомеостаза 12. После ER истощения кальция тапсигаргин, уровни внутриклеточного и внеклеточного изменения люминесценции в противоположных направлениях. Это может быть выражено как отношение, чтобы указать сдвиг в устойчивое распределение состояния датчика (рис 2). Важно отметить, что, как SERCaMP выпуск модулируется экспрессии рецептора KDEL 12, величина выпуска могут изменяться в зависимости от типа клеток. Мы предполагаем, что замена 'ASARTDL' с альтернативными-терминальными последовательностями KDEL типа могут быть необходимы для достижения максиMAL SERCaMP ответ в определенном клеток или тканей типа.
Для анализов в пробирке, уровни внеклеточного Gluc-SERCaMP будет накапливаться в течение долгого времени из-за стабильности секретируемого репортера; мы сообщили приблизительное снижение активности 5-10% после 72 ч 12. Таким образом, обмен среды до начала фармакологической или генетической вызов ER кальциевого гомеостаза может быть необходимо, чтобы уменьшить фоновый сигнал из-за скопления датчика. В противоположность этому, период полураспада Gluc-SERCAMP в естественных это 3.5-4.7 мин 12 с указанием сигнал в плазме представляет собой последнюю версию репортера в циркулирующей крови. После кровь исключая виво и обрабатываются для плазмы, однако, Gluc-SERCaMP очень стабилен (рисунок 5).
Для методик, описанных, средний или плазмы передается непрозрачных 96-луночных планшетах, прежде чем ферментативных анализов. Два важных фактора, чтобы рассмотреть при использовании Gluc журналистомс являются флэш-кинетики фермента и пробой коэлентеразин подложки. Пластинчатые читатели, оснащенные инжекторами лучше всего подходят для работы Gluc ферментативные анализы, чтобы нормализовать время между подложкой и того измерений люминесценции. Химические свойства коэлентеразина сделать его склонным к распаду, что исключает сравнение необработанные значения люминесценции, измеренные в различные моменты времени после приготовления субстрата. Fold различия между образцами, однако, сохраняются (фиг.6), что позволяет относительное различие между контрольной и экспериментальной выборок, которые необходимо отслеживать в течение срока эксперимента (рис 9).
Возможность отслеживать колебания ER кальция в естественных условиях является выгодным при расследовании прогрессирующими болезнями. В то время как другие методы, такие как флуоресцентные красители цитоплазматических, подходят для острых в пробирке исследования, репортер SERCaMP является первым, чтобы мониторинг кальция продольной ER. Оуг протокол описывает прямые печени инъекции AAV-Gluc-SERCaMP. Мы обнаружили устойчивый уровень Gluc-SERCaMP в обращении безраздельного животных в течение 56 дней после инъекции (последнее временной точки проходят до сих пор) и предсказать более длинные эксперименты возможны 12. AAV векторы являются небольшими по размеру, площадью примерно 20 нм в диаметре, и представляют минимальные требования биобезопасности 19. Чтобы обойти преобразование AAV одноцепочечной генома к двухцепочечной ДНК, AAV-SERCaMP был упакован как AAV серотипа 1 двухцепочечной вектора 20. AAV серотипа 1, как было показано, чтобы эффективно преобразовывать печени крыс 19,21; Однако, предостережение нашей техники инъекции потенциал для вируса путешествовать в другие ткани по всему телу. Хотя вектор непосредственно впрыскивается в печени, наша методика, как представлено не может различить источник SERCaMP выпуска, и, следовательно, вполне возможно, что другие, чем печени ткани может способствовать Gluc-SERCСигнал усилителя. Будущие генетические манипуляции будет ограничивать выражение целевой типы тканей. Например, тканеспецифические Cre линии водитель пересек с Cre-зависимой Gluc-SERCaMP позволит тканеспецифической мониторинга ER кальция через проб плазмы.
Описанная методика в естественных использует низкие вирусные титры Благодаря прочной природы репортера. Gluc-SERCaMP релиз может быть обнаружен вирусный диапазоне 7,6 х 10 7 В.Г. 7,6 х 10 9 VG (рисунок 4). Этот диапазон 4-400 раз ниже, чем сообщалось в предыдущей работе, использующей люциферазы светляков на основе вирусных инъекций печени 19. При более высоких концентрациях, мы наблюдали потерю экспрессии этого с течением времени, что возможно из-за иммунного ответа животного на трансгена 22. Более высокие титры вируса следует избегать, когда это возможно из-за повышенной вероятности потери сигнала. Нижние титры, чем те, представлены не бытьан испытания. Этот протокол описывает инъекции AAV-Gluc-SERCaMP в печени; Аналогичные подходы в теории возможно для других типов тканей. Такие параметры, как концентрации вируса и серотипа должна быть оптимизирована для экспрессии в достаточной других тканей.
Благодаря прочной природы репортера, небольшие объемы крови (100-150 мкл) может быть собрано из хвостовой вырезки, позволяя для повторных экспериментов по всей коллекции. Это было полезно для продольной характеристике Gluc-SERCaMP выпуска в ответ на тапсигаргин, где мы наблюдали повышенные уровни после введения тапсигаргин последующим возвращением к исходным уровням (рис 4). Правильное обращение плазменных образцов После сбора крови также важен. Таким образом, мы показали, что SERCaMP стабилен в плазме хранили при 4 ° С до 72 ч до анализа ферментативной (фиг.5). Кроме того, образцы плазмы можно пройти по меньшей мере три замораживания / тХо циклов с минимальным влиянием на люминесценцию (рис 5). На практике, мы храним все образцы при -80 ° C, избегать ненужных циклов замораживания-оттаивания до оценки ферментативный анализ, и анализировать все образцы для эксперимента, в то же время.
ER истощение кальция участвует в патогенезе различных заболеваний. Это часто считается выше по потоку событие, которое препятствует клеточные функции, что приводит к активации разложенном ответ белка (УПО). УПО является адаптивным ответом на работу в ER, чтобы восстановить гомеостаз условия 5. Хронические состояния ER стресса превышает возможности УПО восстановить гомеостаз, в конечном итоге приводит к гибели клеток. ER стресс и ER нарушение регуляции кальция наблюдается в таких заболеваний, как сахарный диабет типа 1, диабетическая нефропатия, нейродегенеративных заболеваний и сердечно-сосудистых dieases 5. Соотношение между нарушением регуляции кальция и патогенеза болезни, однако, difficии очертить. Технология SERCaMP имеет потенциал, чтобы отслеживать этот процесс в течение жизни животного, обеспечивая тем самым понимание развития болезни и прогрессирования. Кроме того, оценка потенциальных терапевтических предназначенных для предотвращения или устранения ER нарушение регуляции кальция может быть оценена путем использования SERCaMP. Наконец, выявление заболеваний, где Gluc-релиз SERCaMP Происходит предлагает возможность спроектировать и использовать секретируемые терапевтические белки или пептиды, как SERCaMPs как средство заболевания регулируется генной терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | Fisher | 02-682-550 | |
| 10% NP-40 solution | Pierce | 28324 | for intracellular GLuc assays |
| 1 ml luer-lok syringes | Fisher | 14-823-30 | |
| 200 microliter filter tips | Rainin | RT-L200F | |
| 3-0 surgical sutures | Fisher | NC9598192 | |
| 30 G needles | Fisher Scientific | 14-821-13A | |
| Adhesive microplate sealing sheets | Thermo | AB-0558 | |
| Alcohol prep pads | Fisher | 22-246-073 | |
| Anesthesia Auto Flow System | E-Z Anesthesia | EZ-AF9000 | |
| Animal recovery chamber | Lyon Vet | ICU-912-004 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Betadine solution | Fisher | NC9386574 | |
| Bleach | Clorox | n/a | |
| Bovine growth serum | Thermo | SH30541.03 | |
| Coelenterazine, Native | Regis Technologies | 1-361204-200 | |
| Cotton tipped applicators | Puritan | 806-WC | |
| Cutting needles 3/8 circle sutures | WPI | 501803 | |
| Digital ultrasconic cleaner | Fisher Scientific | FS60D | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate | Life Technologies | 10569-010 | |
| DNA mass ladder | Life Technologies | 10496-016 | |
| Gaussia luciferase (recombinant protein) | Nanolight | 321-100 | |
| Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC) | New England Biolabs | E8023S | 1:2,000 (WB) |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | DS-401 | |
| Gluc assay plates (96 well, opaque) | Fisher | 07-200-589 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14175-095 | |
| Heparin | Allmedtech | 63323-276-02 | |
| Isoflurane | Butler Schein | 29404 | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Kwik Stop Styptic powder | Butler Schein | 5867 | |
| L-glutamine | Sigma | G8540 | |
| Methanol | Fisher | a452-4 | |
| Microfuge 22R Centrifuge | Bekman Colter | 368831 | |
| Neosporin | Fisher | 19-898-143 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nikon Stereoscope | Nikon | SMZ745T | |
| Nucleospin Gel and PCR Cleanup | Machery-Nagel | 740609 | |
| P200 pipet | Rainin | L-200XLS+ | |
| p24 Lenti-X rapid titer kit | Clontech | 632200 | |
| PCR film seal | Fisher | AB0558 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| ReFresh Charcoal Filter canister | E-Z Anesthesia | EZ-258 | |
| Scalpel blades, #10 | Fine Science tools Inc | 10010-00 | |
| SD rats 150-200 g | Charles River | Rats | rats ordered at 150-200 g. Surgery 5 days after arrival |
| Small animal ear tags | National Band and Tag co | 1005-1 | |
| Sterile surgical drapes | Braintree Scientific | SP-MPS | |
| Synergy 2 plate reader | BioTek | n/a | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | harmful to human health |
| Virapower lentiviral packaging mix | Life Technologies | K4975-00 | |
| Xfect Transfection reagent | Clontech | 631318 | |
| Xylazine | Valley Vet | 468RX |
References
- Sitia, R., Braakman, I. Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory. Nature. 426 (6968), 891-894 (2003).
- Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38 (3-4), 303-310 (2005).
- Fu, S., et al. Aberrant lipid metabolism disrupts calcium homeostasis causing liver endoplasmic reticulum stress in obesity. Nature. 473 (7348), 528-531 (2011).
- Micaroni, M. The role of calcium in intracellular trafficking. Curr Mol Med. 10 (8), 763-773 (2010).
- Mekahli, D., Bultynck, G., Parys, J. B., De Smedt, H., Missiaen, L. Endoplasmic-reticulum calcium depletion and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (6), (2011).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
- Whitaker, M. Genetically encoded probes for measurement of intracellular calcium. Methods Cell Biol. 99, 153-182 (2010).
- Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
- Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153 (2014).
- Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44 (4), 386-399 (2008).
- Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Richie, C. T., Harvey, B. K. SERCaMP: a carboxy-terminal protein modification that enables monitoring of ER calcium homeostasis. Mol Biol Cell. 25 (18), 2828-2839 (2014).
- Henderson, M. J., Richie, C. T., Airavaara, M., Wang, Y., Harvey, B. K. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) secretion and cell surface binding are modulated by KDEL receptors. J Biol Chem. 288 (6), 4209-4225 (2013).
- Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proc Soc Exp Biol Med. 130 (1), 305-310 (1969).
- Zigler, J. S., Lepe-Zuniga, J. L., Vistica, B., Gery, I. Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium. In Vitro Cell Dev Biol. 21 (5), 282-287 (1985).
- Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro. Virology. 372 (1), 24-34 (2008).
- Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin. Thromb Haemost. 70 (6), 1024-1029 (1993).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (4), 582-591 (2009).
- Sobrevals, L., et al. AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers. Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).
- Wang, Z., et al. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).
- Seppen, J., et al. Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats. Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).
- Hareendran, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them. Rev Med Virol. 23 (6), 399-413 (2013).
