Abstract
内皮細胞は、血管の内壁を裏打ちし、血管緊張、血管透過性、および新血管形成の調節に重要な役割を果たしています。内皮細胞の機能障害は、虚血性心疾患を含む多くの心血管疾患の発症および進行に関与しています。冠動脈内皮細胞の機能と特徴付けを調べるために、細胞の単離は、最初のステップであり、それはその後の実験を行うために、高純度と量を必要とします。このプロトコルは、成体マウス冠動脈内皮細胞を単離するための効率的な方法を説明します。マウスの心臓を切開し、小片に刻んだされます。ディスパーゼおよびコラゲナーゼIIを使用して、心臓の消化の後、細胞を洗浄し、抗CD31抗体に結合された磁気ビーズと共にインキュベートしました。内皮細胞とビーズを数回洗浄し、様々な用途で使用する準備ができている、イメージングおよび分子生物学的experime含めていますNTS。効率的な分離は、90％以上の純度で1心あたり約10 4個の細胞が得られます。
Introduction
様々な心血管疾患および代謝性疾患のマウスモデルは、患者に見られるものと類似している生理学的および分子的変化を負います。さらに、マウスの遺伝的変化は、私たちが疾患の発症と進行における特定の遺伝子の病原性の役割を調査することを可能にする強力なツールです。今日では、細胞型特異的遺伝子ノックインまたはチェックアウトマウスは簡単に多くの研究室で生成され、特定の細胞型におけるmRNAおよびタンパク質レベルの測定は、マウスは本当に遺伝的に変更されたかどうかを決定するための最初のステップであるされています。
内皮は、内皮細胞（EC）のラインの内側血管壁の薄い単層です。内皮細胞は、血管緊張、血管透過性、および新しい血管の形成1,2の調節に重要な役割を果たしています。内皮機能障害は、多くの病的状態および内皮機能の変化の顕著な特徴は、様々な車につながる可能性がありますdiovascular疾患3,4。生理学的および病態生理学的条件下での内皮細胞の機能を研究することが重要です。
電気部品5-8と分離法が使用される組織および種に応じて最適化する必要がある単離するためのいくつかの方法があります。異なる組織からのECは、それらの表面マーカーおよびタンパク質発現9に対して異質の高いレベルを表示するためです。内皮細胞の成功の分離は、しばしば挑戦することと訓練と実践のいくつかの学位を必要とすることができます。達成されると、このプロトコルで提案された単離方法は、安定的かつ効率的であることがわかります。
この方法の全体的な目標は、高品質と量のマウス冠状動脈のEC（MCECs）を得ることです。心臓から採取した細胞の量は、他の技術を用いて他の組織から採取した細胞よりも少ない場合でも、この技術はまだ賭けを提供しますターの品質。得られた集団における内皮細胞の純度は90％以上です。したがって、この技術は、細胞イメージングとして純粋に単離された内皮細胞に依存するアプリケーションのために理想的です。
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Protocol
マウスでの研究は、アリゾナ大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認され、国立衛生研究所（NIH）のガイドラインに従って行きました。
注：セクション1、2および3は、セットアップとして、実験の前日に行われるべきです。
1.準備ソリューション
- CD31バッファー（50ml）で
- 50ミリリットルチューブに50ミリリットルの1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を追加します。 0.05 gでウシ血清アルブミン（BSA）および0.037 gでエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を秤量し、50mlチューブに追加し、粉末が溶解するまで約1時間回転するチューブを置きます。 、pHを7.4に調整し、新しい50ミリリットルチューブに0.2μmのフィルターでろ過し、使用するまで4℃で保存してください。
- HEPESを有するハンクス平衡塩溶液（HBSS）（500mL）で
- HBSS溶液に10mMのHEPESを作り、よく混合するHEPESの1.1915グラムを追加します。 pH値を測定し、7.4に調整します。 4におけるフィルタと店舗˚C。
- 1×クレブス溶液（1 L）
- 1リットルのフラスコに蒸留水を倍増する10×クレブス液[ 表1]の100ミリリットルを追加します。 2.1グラム重炭酸ナトリウムおよび2グラムD-グルコースを計量し、フラスコに追加します。混合し、1 Lに全量を
- フードの内側30分およびフィルタソリューションの95％O 2/5％CO 2ガスとバブルソリューション。 4℃で保存し、実験中氷上に保ちます。
2.磁気ビーズを準備
- 各1.5mlチューブ（サンプルあたり1管）に1ミリリットルCD31バッファを追加します。ヒツジ抗ラットIgGビーズを混合し、各サンプル[ 表1]に適切な量を追加します。勢いよく30回チューブを振ると揺れの1分間磁石板に配置します。プレート上にしながら、チューブを開き、バケットにソリューションをダンプします。
- 各チューブに1ミリリットルCD31バッファを追加します。 2μlのラット抗マウスCD31抗追加します4ºCでチューブO / Nを各チューブにボディと回転します。
3.オートクレーブ
- すべての手術ツールやピペットチップをオートクレーブ。 4直径の異なるヒントがあるように狭いために、最も広いから、ピペットチップの先端をカットします。ヒントのためのおおよその直径はそれぞれ3ミリメートル、2.5ミリメートル、2ミリメートル、および1.5ミリメートルです。ヒントをカットし、121ºCの温度で殺菌の30分に前日オートクレーブ。
注：セクション4から11は、実験の日に行われるべきです。
4.準備ソリューション
- M199で2％の鉄を強化した胎仔血清（IFCS）を含む洗浄バッファーを準備します。イメージングのために、30ミリリットル/マウスを準備します。
- 酵素液（10ミリリットル/サンプル）を準備します。 50ミリリットルチューブに0.6単位/ディスパーゼのミリリットルおよび1mg /コラゲナーゼタイプIIのミリリットルを計量。 M199を追加し、15分間、4ºCでチューブを回転させます。 insid新しい50ミリリットルチューブに0.2μmのフィルターでろ過電子フード、使用するまで4℃に保ちます。
- ヘパリンでHBSS / HEPESを準備します。 15ミリリットルチューブに10 mMのHEPESをHBSSの10ミリリットルを追加します。チューブにヘパリンの100μlを添加して、使用するまで4℃に保ちます。
5.ビーズを洗浄
- 4ºCで回転子からビーズとチューブを取り出し、フードにもたらします。磁性板にチューブを置き、1分間振ります。ソリューションをダンプし、各チューブに1ミリリットルCD31バッファを追加します。
- 磁性板の外管を取り、激しく30回振ります。磁性板に管をバック入れて、合計3回の洗浄のために繰り返します。終了後、4℃に戻し管を入れ、使用するまで回転し続けます。
6.解剖
- 血液凝固を防止するためにヘパリンを0.1 mlをマウスの腹腔内に注入します。 10分待ってから、ペントバルビタールの0.01ミリリットルの腹腔内注射を使用して、マウスを麻酔。マウスが感じているかどうかを確認します足をつまんで痛み。
- 頭を上にしてポリスチレンボード上にマウスを置き、ピンと腕を保持します。喉まで胸部上部の領域で皮膚をカットする鉗子とタフなカットはさみを使用してください。
- ちょうど横隔膜上記の胸郭の中央にカットしてください。心臓や肺を露出する三角形を作るために喉に向かって横向きや上向きに骨をカットします。ちょうど横隔膜の上行大動脈をカットします。
- 引っ張らずにピンセットで胸腺を持ち、一緒に肺と心臓を除去するために慎重に任意の結合組織を切断するはさみを使用しています。 1×クレブスを入れたビーカーに入れ組織は、鉗子で振ると1×クレブスで6センチメートル皿に移します。
- ハサミやピンセットを用いて肺葉を削除します。大動脈に20 G滅菌カテーテルを挿入します。 HBSS /ヘパリンと冠状動脈循環系に血液をフラッシュします。心室の小さなカットを行い、M199のサンプルチューブに心臓や転送を振ります。氷の上にチューブを保管してください。
- 酵素液10mlを充填した6センチメートル皿に心を移し、はさみを使用して小片にそれをミンチ。 15分間、37ºCインキュベーターに皿を置きます。組織が容易に通過できるようにするために切断端と先端を通って下方に30回ピペッティングによって消化された材料を攪拌します。
- さらに15分間37ºCインキュベーターでそれを元に戻します。攪拌を3回繰り返して、最大の開口部からピペットチップを使用して、各時間が狭いと、それぞれの間に15分間インキュベーションします。
- 最後の15分間のインキュベーション後、アウトとフードにサンプルを取ります。ピペット溶液を上下に30回、最も狭い開口部を有するピペットチップを使用して、新しい50ミリリットルチューブに40μmのセルストレーナーを通過します。
- 10mLのピペットを用いて10mLの洗浄緩衝液で皿を洗浄し、セルストレーナーに移します。 RTで10分間、400gで遠心分離し、スピンに50ミリリットルチューブを入れてください。
- ペレットを中断することなく、上清を取り除きます。二回5ミリリットル洗浄バッファーで細胞を洗浄。
- 以前の1は、一度に1つのチューブにビーズや仕事1.5 mlチューブを用意しましょう。 、磁性板で1 1.5mlチューブを入れて3回振ると、それを開きます。
- 最後の遠心分離後、ペレットを中断することなく、できるだけ多くの上清を除去します。積極的にフリックすることにより細胞塊の関連付けを解除します。
- 50mlチューブに1mLの洗浄緩衝液を追加し、1 mlピペットで細胞を混合します。 1.5ミリリットルチューブからソリューションをダンプし、ビーズに50ミリリットルチューブから細胞懸濁液の1ミリリットルを追加します。チューブを30回フリック、その後30分間、4ºCで回転します。
9.細胞培養/イメージングのための準備
- 細胞をプレーティングするためのチャンバーを準備します。表面もコーティングするためにチャンバーにゼラチン溶液（w / vの5％、300μl）を加え、37ºCで30分間インキュベートします。インキュベーション後、REMオベゼラチン及び乾燥した表面。
- 回転の30分後にビーズ/細胞とチューブを取り出し、フード内部の磁気プレートに入れました。 2分、ダンプのために振ると1ミリリットルの洗浄緩衝液を追加します。
- プレートの外にチューブを取り、勢いよく30回、その後フリック30回振ります。磁性板でそれらを元に戻し、1分間振ります。 5回の洗浄の合計4回繰り返したが、1分がプレートに振盪しながら。
- 最後の洗浄後、1チューブを取り出して、時に各チューブ1に取り組んでいます。その後、30回フリック30回振ります。磁性板の上に置き、1分間振ります。ダンプと1ミリリットル20％IFCS ECのメディアを追加（37ºCで予め温めておきました）。
- 勢いよく30回、その後フリック30回振ります。 500μlのピペットを上下に10回ピペットを調整します。各チャンバーに500μlのを転送します。
- 37ºCインキュベーターに入れて、O / Nを残します。翌日、10％FBS EC培地で細胞を洗浄。
ウェスタンブロット（WB）サンプルについて10の準備
- ターク回転の1時間後にビーズ/細胞とチューブを電子。磁気プレートに入れ、2分間振ります。上清をダンプし、冷HBSS 1ミリリットルを追加します。勢いよく30回、その後フリック30回振ります。 3回の洗浄のために二度繰り返しますが、1分がプレートに振盪しながら。
- 最後の洗浄後、磁性板にチューブを入れて、1分間振ります。ピペットを使用してバッファを削除し、以前に11,12を説明した方法を用いて、WBのための細胞を溶解します。収集された溶解物を、通常は約30μgのタンパク質のが含まれています。
11.イメージング
- チャンバー250μlの最終容量で、メディアで細胞を3回洗浄します。細胞へのDil-acLDLの1.5μlを添加します。この点から、暗闇の中で細胞を維持します。
- 37℃で3.5時間インキュベートします。 、ヘキストの1.5μLを加え、よく混ぜて、PBSで37˚C.Wash細胞で30分間インキュベートし、室温で20分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定します。
- PBSで2回洗浄し、30マイル、5％BSA-PBSでブロックRTでのn。 1％BSA-PBSで2回洗浄します。 2μg/ mlの濃度に1％BSA-PBSを用いてBS-レクチン-FITCを希釈し、各チャンバーに300μlを添加します。
- 室温で30分間オービタルシェーカー上室を置きます。 PBSで3回洗浄します。
- FITC（レクチン染色、ECマーカー、励起/発光の488nm / 519 nm）を、DAPI（ヘキスト、358 nmでの核染色、励起/発光/ 30ミリ秒200ミリ秒の露光時間で蛍光顕微鏡下で細胞を可視化461 nm）であり、557 nmの/ 576 nm）におけるTRITC（acLDL染色、ECマーカー、励起/発光のための300ミリ秒。 20X対物レンズを使用して画像を取得します。
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Representative Results
マウスの心臓から冠動脈内皮細胞の正常な分離は、典型的には、石畳の形状と90％以上の純度で約10 4個の細胞が得られます。内皮細胞の純粋な集団のために、注意が汚染のない無菌環境を確保するためのプロトコル全体で取られるべきです。細長い細胞または集団内の拡大された細胞の出現は、他の細胞型、平滑筋細胞および線維芽細胞の混入を示します。内皮細胞の純度試験は、内皮細胞表面マーカー、BS-レクチン及びacLDL（ 図1）で細胞を染色することによって行われます。両方の色を呈する陽性細胞のパーセンテージはMCECで90％以上でした。このような結果は、技術が正常に実行されたことを示しています。
| PBS（10×）（1 L） | </ TD> | ||
| 材料 | MW | 量（g） | |
| NaClを | 58.44 | 80 | |
| 塩化カリウム | 74.55 | 2 | |
| Na 2 HPO 4 | 141.96 | 6.1 | |
| KH 2 PO 4 | 136.08 | 2 | |
| クレブス（10倍）（1 L） | |||
| 材料 | MW | コンク（MM） | 量（g） |
| NaClを | 58.44 | 118 | 69 |
| 塩化カリウム | 74.56 | 4.7 | 3.5 |
| CaCl 2•2H 2 O | 147 | 1.8 | 2.6 |
| 硫酸マグネシウム4•7H 2 O | 246.5 | 1.2 | 2.96 </ TD> |
| NaH 2 PO 4 | 120 | 1.2 | 1.44 |
| EC培地（20％）（500mL）で | |||
| 材料 | 量 | ||
| M199 | 444.5ミリリットル | ||
| 10から20 U / mlのヘパリン | 500μlの | ||
| D-バリン | 25 mgの | ||
| IFCS | 100ミリリットル | ||
| EGS | 10 mgの | ||
| ペニシリン/ストレプトマイシン | 5ミリリットル | ||
| ビーズの量は、1回のマウスに使用されます | |||
| イメージングのための | 5μlの | ||
| FまたはWB / PCR | 10μlの | ||
表1使用した溶液の化学組成。
MCECs。蛍光画像の 図1. 代表的な画像を心臓から単離したマウス冠状動脈のEC（MCEC）はECの人口の高純度を示すことを示しています。純度はMCECに緑色（B）に赤色（A）のacLDL取り込みおよびレクチン染色の両方で試験しました。核は青色（C）にヘキストで染色しました。両方の色を呈する陽性細胞のパーセンテージはMCECで90％以上でした。バーは20μmの代表である。 より大きな輸出自主規制を表示するには、こちらをクリックしてください。この図のイオン。
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Discussion
研究において最も広く使用されている内皮細胞は、その利便性と培養の容易さのヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）です。しかし、多くの研究は、他の特定の臓器10からの内皮細胞の単離によって達成生理学的モデルの可用性を必要とします。内皮細胞は、心臓組織内の細胞の非常にマイナーな人口を構成しています。それらの単離および培養は非常に困難であることを証明することができます。
このプロトコル内の3つの重要なステップがあります。最初は、血液をよくフラッシュすることです。血液中の白血球は、細胞表面マーカーとしてCD31を発現し、CD31抗体の結合についてのECに対して競合するように、これは、必要です。他の内皮細胞は、血液中に存在することができるように、フラッシングは、このような細胞による汚染を防止するために不可欠です。第二の重要な工程は、分離プロセスを通じて無菌環境を維持することです。任意の汚染RESU達成細胞の数の劇的な減少でLTS。最後に、第三の重要なステップは、そうしないとは分離の効率を低下させるように、CD31の緩衝液のpHを調整することです。
細胞質は、この分離の際に最も重要です。平滑筋細胞の増殖は、培養培地へのヘパリンの適切な量を添加することにより抑制することができます。線維芽細胞の増殖は、メディアにD-バリンを追加することによって減速することができました。内皮細胞はpopulation.The内皮細胞表現型の純度を試験するために、BS-レクチンとのDil-AcLDLおよび共染色の取り込みを特徴とすることができることは不安定であり、それらの動作を迅速に一度元の組織から取り出して変更することができ培養しました。技術の限界は、細胞が、彼らはまだ彼らの表現型を保持していることを保証するために、培養の5日後に使用すべきではないということです。強く細胞に合格しないことをお勧めします。初代細胞は、一貫性のあるRESUを提供しますLT。
全体的に、この技術は、優れた純度の細胞のかなりの数になります。必要なスキルと、分離処理は6時間以内に完了することができます。これは、細胞培養または分子生物学的実験のいずれかにマウス冠状動脈内皮細胞を得るための素晴らしい方法を提供します。
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Acknowledgments
この作品は、国立衛生研究所（A.牧野へHL115578）からの助成金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| DynaBeads pan mouse IgG beads | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Rat anti-mouse CD31 Antibody | BD Biosciences | 550274 | |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | I3021-50 ml | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma | P0044-1ml | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-1 ml | |
| Heparin | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | Corning | 356006 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher/Mediatech | MT-30-002-CI |
References
- Michiels, C.
- Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A.
- Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91, 3527-3561 (1998).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115, 1285-1295 (2007).
- Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung. Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).
- Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).
- Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev Cell. 26, 204-219 (2013).
- Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice. J Vis Exp. , (2010).
- Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).
- Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. VDAC: old protein with new roles in diabetes. Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).
