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Biochemistry

Rilevamento del pH-dipendente attività di Published: October 23, 2016 doi: 10.3791/54527
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan, 2Howard Hughes Medical Institute, University of Michigan

Summary

Questo studio descrive le tecniche biofisiche, biochimiche e molecolari per caratterizzare l'attività chaperone di Escherichia coli HdeB in condizioni di pH acido. Questi metodi sono stati applicati con successo per altri accompagnatori acido-protettivi come HdeA e può essere modificato a lavorare per altri accompagnatori e condizioni di stress.

Abstract

I batteri sono spesso esposti ai cambiamenti ambientali, come ad esempio le alterazioni di pH, la temperatura, lo stato redox, l'esposizione alla luce o forza meccanica. Molte di queste condizioni causare proteine ​​dispiegarsi nella cella e avere un impatto negativo sulla sopravvivenza dell'organismo. Un gruppo di, chaperon molecolari indipendenti specifici di stress hanno dimostrato di svolgere un ruolo essenziale per la sopravvivenza di queste condizioni di stress. Mentre completamente piegata e chaperone-inattivo prima dello stress, queste proteine ​​rapidamente svolgersi e diventare chaperone-attiva in condizioni di stress particolari. Una volta attivato, questi chaperon condizionatamente disordinati legano ad un gran numero di differenti proteine ​​di aggregazione-inclini, prevenire la loro aggregazione e direttamente o indirettamente facilitare proteina ripiegamento su ritorno a condizioni di non-stress. L'approccio principale per ottenere una comprensione più dettagliata del meccanismo della loro attivazione e cliente riconoscimento comporta la purificazione e subsequent caratterizzazione di queste proteine mediante saggi in vitro chaperone. Follow-up in saggi di stress in vivo sono assolutamente essenziali per confermare in modo indipendente l'ottenuto dei risultati in vitro.

Questo protocollo descrive in vitro e in vivo metodi per caratterizzare l'attività chaperone di E. coli HdeB, un chaperone acido attivato. Misure di light scattering stati usati come una comoda lettura per la capacità di HdeB per prevenire l'aggregazione indotta da acido di un consolidato proteine client modello, MDH, in vitro. esperimenti ultracentrifugazione analitici sono stati applicati per rivelare la formazione di complesso tra HdeB e la sua LDH proteine ​​cliente, di fare luce sulla sorte di proteine ​​clienti al loro ritorno a condizioni di non-stress. saggi di attività enzimatica della proteine ​​clienti sono stati condotti per monitorare gli effetti della HdeB sul pH indotta inattivazione del cliente e la riattivazione. Infine, studi di sopravvivenza sono stati usati per Monitor l'influenza della funzione di accompagnatore di HdeB in vivo.

Introduction

Un ambiente naturale comune in cui gli agenti patogeni microbici sperimentano proteine condizioni dispiegarsi acido-indotta è lo stomaco dei mammiferi (intervallo di pH 1-4), il cui pH acido serve come una barriera efficace contro gli agenti patogeni di origine alimentare 1. Proteine dispiegarsi e aggregazione, che è causato da protonazione catena laterale di aminoacidi, colpisce processi biologici, danni strutture cellulari e alla fine provoca la morte delle cellule 1,2. Poiché il pH del periplasma batterico equilibra quasi istantaneamente con il pH ambientale dovuto alla diffusione libera di protoni attraverso la membrana esterna porosa, proteine di membrana periplasmatiche ed interne di batteri Gram-negativi sono i componenti cellulari più vulnerabili in condizioni acido-stress 3. Per proteggere il loro proteoma periplasmic contro il Rapid danni da acido-mediata, batteri Gram-negativi utilizzano gli accompagnatori periplasmatiche acido attivato HdeA e HdeB. HdeA è un chaperone condizionalmente disordinati 6,7. L'attivazione di HdeA richiede profondi cambiamenti strutturali, tra cui la sua dissociazione in monomeri, e parziale che si svolgevano dei monomeri 6-8. Una volta attivato, HdeA si lega alle proteine ​​che si svolgono in condizioni acide. Si previene efficacemente la loro aggregazione sia durante l'incubazione a pH basso così come su pH di neutralizzazione. Al ritorno a pH 7,0, HdeA facilita il ripiegamento delle proteine cliente in forma di ATP-indipendenti e converte di nuovo nella sua dimerica, conformazione chaperone-inattiva 9. Allo stesso modo, il chaperone HdeB omologa è anche chaperone-inattivo a pH 7,0. A differenza HdeA, tuttavia, l'attività di accompagnatore HdeB raggiunge il suo massimo apparente a pH 4.0, condizioni in cui HdeB è ancora in gran parte piegata e dimerici 10. Inoltre, abbassando ulteriormente le Caus pHes l'inattivazione di HdeB. Questi risultati suggeriscono che, nonostante la loro ampia omologia, HdeA e HdeB differiscono nella loro modalità di attivazione funzionale che permette loro di coprire un ampio intervallo di pH con la loro funzione protettiva chaperone. Un altro accompagnatore che è stato implicato nella resistenza agli acidi di E. coli è il citoplasmatica Hsp31, che sembra stabilizzarsi proteine clienti ripiegate fino a condizioni neutre vengono ripristinati. La modalità d'azione preciso di Hsp31, tuttavia, è rimasto enigmatico 12. Dato che altri batteri enteropatogeni come Salmonella mancano dell'operone hdeAB, è molto probabile che potrebbero esistere altri accompagnatori periplasmatiche ancora non identificati che sono coinvolti nella resistenza agli acidi di questi batteri 11.

I protocolli qui presentati consentono di monitorare l'attività chaperone pH-dipendente di HdeB in vitro e in vivo 10 e possono essere applicati per investigare altri accompagnatoriquali Hsp31. In alternativa, la complessa rete di fattori di trascrizione che controllano l'espressione di hdeAB può potenzialmente essere studiata con il test di stress in vivo. Per caratterizzare la funzione delle proteine chaperone in vivo, diverse configurazioni sperimentali possono essere applicati. Una via è quella di applicare proteine ​​dispiegarsi condizioni di stress e fenotipicamente caratterizzare ceppi mutanti che o iperesprimono il gene di interesse o portare una delezione del gene. Studi di proteomica possono essere condotti per identificare quali proteine non è più aggregato in condizioni di stress quando il chaperone è presente, o l'influenza di un accompagnatore su un enzima specifico può essere determinato in condizioni di stress utilizzando saggi enzimatici 14-16. In questo studio, abbiamo scelto di iperespressione HdeB in un ceppo rpoH cancellazione, a cui manca il fattore sigma shock termico 32. RpoH controlla l'espressione di tutti i principali E. accompagnatori coli e la sua eliminazione è noto per aumentare sensitivity a condizioni di stress ambientali che causano la proteina dispiegarsi 15. Il vivo l'attività di chaperone di HdeB è stata determinata monitorando la sua capacità di sopprimere la sensibilità pH del ceppo Δ rpoH. Complessivamente, i protocolli qui presentati forniscono un approccio veloce e semplice per caratterizzare l'attività di un chaperone acido attivato in vitro e nel contesto in vivo.

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Protocol

1. Espressione e purificazione di periplasmic HdeB

NOTA: HdeB è stato espresso in E. coli che ospitano il plasmide pTrc- hdeB 10, e purificato dal periplasma su polimixina lisi.

  1. Preparare una cultura durante la notte di E. coli che ospitano il plasmide pTrc- hdeB 10 a 30 ml di LB contenente 200 mg / ml di ampicillina (LB Amp). Seminare quattro 1 L culture di LB Amp e crescere a 37 ° C e 200 rpm fino a raggiungere OD 600nm di 0,7. Quindi, aggiungere 300 mM IPTG per indurre l'espressione di HdeB e diminuire la temperatura di crescita a 30 ° C.
  2. Dopo 5 ore di espressione proteica a 30 ° C, raccogliere le cellule per centrifugazione a 8.000 xg per 5 minuti a 4 ° C.
  3. Lavare il pellet con 100 ml di tampone A (50 mM Tris / HCl, 50 mM NaCl, pH 7,5) e centrifugare le cellule di nuovo a 8000 xg per 5 minuti a 4 ° C.
  4. Successivamente, risospendereil pellet cellulare in 80 ml di tampone A contenente 1 mg / ml di solfato di polimixina. Per efficiente rottura della membrana esterna, mescolare delicatamente la sospensione per 1 ora a 4 ° C.
  5. Per rimuovere la frazione citoplasmatica e detriti cellulari, centrifugare la sospensione per 20 min a 15.000 xg a 4 ° C. Ciò si traduce in ~ 60 ml surnatante contenente la HdeB solubile.
  6. Dializzare supernatante contenente l'estratto periplasmic overnight contro il volume 150x di tampone B (20 mM Tris / HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8,0) con una membrana di dialisi con 6 kDa MW cut-off. Concentrare le proteine ​​a 15 ml utilizzando unità filtro centrifugo con un peso molecolare di cut-off di 3 kDa. Filtrare la soluzione proteica utilizzando un filtro da 0,2 micron pori.
  7. Applicare la proteina su una colonna di cromatografia a scambio anionico (volume colonna 5 ml) che è stata equilibrata con 5 volumi di colonna di buffer B con una portata di 2,5 ml / min. Una volta che la proteina è caricato sulla colonna, lavare la colonna con tampone B per 10 min auna portata di 2,5 ml / min. Eluire HdeB con un gradiente lineare da 0 a 0,5 M NaCl in tampone B per un periodo di 50 min con una portata di 2,5 ml / min 6.
  8. Identificare frazioni contenenti HdeB utilizzando un 15% SDS-PAGE. Mescolare 20 ml del campione con 5 ml 5x ridotto tampone di caricamento SDS. Carico 10 microlitri sul gel ed eseguire in tampone Tris-glicina (14,4 g / L glicina, 2,9 g / L Tris, 1 g / L di sodio dodecil solfato, pH 8,3). Attivare il gel a 150 V finché la banda di bromofenolo ha migrato vicino al fondo del gel (~ 45 min).
  9. Pool tutte le frazioni HdeB contenenti, dializzare a 4 ° C overnight contro tampone di conservazione HdeB 4 L (50 mM Tris / HCl, 200 mM NaCl, pH 8,0), e concentrare la proteina di circa 300 micron usando unità filtro centrifugo con un peso molecolare cut-off di 3 kDa. Determinare la concentrazione di HdeB a 280 nm utilizzando il coefficiente di estinzione 280nm ε = 15.595 M -1 cm -1. Preparare aliquote di 100 microlitri e senza flashze le aliquote in azoto liquido.
    NOTA: HdeB può essere conservato a -70 ° C per almeno 6 mesi.

2. Chaperone attività Assay Utilizzando termicamente Unfolding malato deidrogenasi (MDH)

NOTA: L'influenza di HdeB purificato sull'aggregazione di dispiegamento termicamente porcine mitocondriale malato deidrogenasi (MDH) a diversi valori di pH è stata monitorata come descritto di seguito. Tutte le concentrazioni di proteine ​​elencate si riferiscono alla concentrazione monomerica.

  1. Per preparare MDH, dializzare MDH a 4 ° C overnight contro 4 L tampone C (50 potassio fosfato mM, 50 mM NaCl, pH 7,5) e concentrare la proteina a circa 100 micron usando unità filtro centrifugo con un peso molecolare di cut-off di 30 kDa.
    NOTA: è necessaria la dialisi attento della MDH MDH come viene fornito come soluzione di solfato di ammonio.
  2. Per rimuovere aggregati, centrifugare la proteina per 20 minuti a 20.000 xga 4 ° C. Determinare la concentrazione MDH da assorbanza a 280 nm (ε <sub> 280 nm = 7,950 M -1 cm -1). Preparare 50 aliquote microlitri di MDH e flash-congelare le aliquote per la conservazione.
  3. Mettere 1 ml di quarzo cuvetta in uno spettrofotometro a fluorescenza dotato di supporti del campione a temperatura controllata e agitatore. Impostare λ ex / em a 350 nm.
  4. Aggiungere volumi adeguati di pre-riscaldato (43 ° C) tampone D (150 mm potassio fosfato, 150 mM NaCl) ai valori desiderati di pH (qui: pH 2.0, pH 3,0, pH 4.0 e pH 5,0) alla provetta e set la temperatura nel supporto cuvetta a 43 ° C. Il volume totale è di 1.000 ml.
  5. Aggiungere 12,5 mM HdeB (o in alternativa lo stesso volume di tampone di conservazione HdeB per il controllo del buffer) al buffer, seguita dall'aggiunta di 0,5 mM MDH. Inizia il monitoraggio dispersione della luce. Incubare la reazione per 360 secondi per consentire sufficiente svolgersi della MDH.
  6. Sollevare il pH a 7 con l'aggiunta di 0,16-0,34 volume di 2 M K senza buffer 2 HPO 4 e continuare recondo dispersione della luce per un altro 440 sec.
  7. Impostare la portata di MDH aggregazione registrata in assenza del chaperone in un punto temporale definito dopo neutralizzazione (qui dopo 500 secondi, quando è stata osservata la massima diffusione della luce di MDH) al 100%. Normalizzare l'attività di HdeB al segnale dispersione della luce della MDH in assenza di HdeB a ciascun valore pH indicato.

3. Rilevamento di HdeB-LDH formazione del complesso da Analytical Ultracentrifugazione (AUC)

NOTA: sedimentazione esperimenti di velocità di HdeB da solo o in complesso con dispiegarsi termicamente lattato deidrogenasi (LDH) sono state eseguite utilizzando un'ultracentrifuga analitica.

  1. Per preparare LDH, dializzare LDH a 4 ° C overnight contro 4 L tampone C (50 mM di fosfato di potassio, 50 mM NaCl, pH 7,5) e concentrare la proteina a circa 200 micron usando unità filtro centrifugo con un peso molecolare di cut-off di 30 kDa.
    NOTA: la dialisi attento di LDH è richiesto come LDH viene fornito come soluzione di solfato di ammonio.
  2. Per rimuovere aggregati, centrifuga LDH per 20 minuti a 20.000 xga 4 ° C. Determinare la concentrazione LDH da assorbanza a 280 nm (ε 280 nm = 43.680 M -1 cm -1). Preparare 50 aliquote microlitri di LDH e flash-congelare le aliquote per la conservazione.
  3. Incubare 3 mM LDH in presenza e assenza di 30 mM HdeB in tampone D (pH 4 e 7, rispettivamente) per 15 min a 41 ° C.
    NOTA: L'incubazione di LDH alle più alte temperature provoca la sua completa aggregazione, e nessun effetto chaperone di HdeB possono essere osservati.
  4. Lasciate che i campioni raffreddare a temperatura ambiente. Poi, i campioni di carico in cellule che contengono il settore di serie a forma di centrotavola a 2 canali con 1,2 cm Lunghezza percorso. Caricare le cellule nel ultracentrifuge ed equilibrare a 22 ° C per almeno 1 ora prima di sedimentazione.
  5. campioni Spin a 22 ° C e 167.000 xg nel rispettivo rotore per 12 ore, e monitorare l'sedimentation della proteina continuo a 280 nm. Come precedentemente dimostrato, il rapporto segnale-rumore è migliorata quando l'intensità della luce trasmessa di ogni canale è misurata anziché assorbanza. Ciò migliora anche la qualità del successivo montaggio dei dati.
  6. Condurre analisi dei dati con SEDFIT (versione 15.01b dicembre 2015), con il continuo c (s) la distribuzione del modello 17. Un tutorial che descrive come utilizzare SEDFIT può essere trovato in riferimento 18.
    1. Impostare il livello di confidenza per la ME (massima entropia) regolarizzazione a 0,7.
  7. Calcolare la densità del buffer così come la viscosità utilizzando SEDNTERP 19. Per stimare la quantità di proteine ​​client aggregata, confrontare gli integrali di LDH sedimentato in pH 4 a pH 7 come riferimento.
    NOTA: L'integrazione delle trame di distribuzione sedimentazione può essere fatto direttamente in SEDFIT. Software alternativo per analizzare i dati di velocità di sedimentazione può essere trovato in una recente revisione di 20. </ Li>

4. Monitoraggio MDH inattivazione e riattivazione in presenza di HdeB

NOTA: L'influenza di HdeB purificato il ripiegamento di pH spiegato MDH stata determinata monitorando l'attività MDH sulla neutralizzazione.

  1. Incubare 1 mM MDH in tampone D ai valori desiderati di pH (qui: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 e pH 5,0) per 1 ora a 37 ° C in assenza o presenza di 25 mM HdeB. Quindi, spostare la temperatura a 20 ° C per 10 min.
    NOTA: Nessuna refolding MDH è stata osservata anche in presenza di HdeB quando MDH stata incubata a temperature superiori a 37 ° C.
  2. Per avviare ripiegamento di acido denaturato MDH, neutralizzare i campioni a pH 7 per aggiunta di 0,13-0,42 volume di 0,5 M sodio fosfato, pH 8,0.
  3. Dopo incubazione per 2 ore a 20 ° C, determinare l'attività MDH monitorando la diminuzione di NADH a 340 nm 9.
    NOTA: MDH catalizza la riduzione NADH-dipendente dell'ossalacetato in L-malato. Mescolare 50 ml di reazione incubazione con 950 microlitri di tampone (50 mM sodio fosfato, pH 8,0, 1 mM ossalacetato, e 150 pM NADH).
    NOTA: La concentrazione finale di MDH nel tampone dovrebbe essere 44 nM.
  4. Monitorare la variazione di assorbanza con uno spettrofotometro, dotato di un blocco di controllo di temperatura Peltier impostato a 20 ° C.
  5. Segnala l'attività MDH rispetto al 44 nM nativo MDH che è stato mantenuto a pH 7,0.

5. Effetto della sovraespressione HdeB su E. coli di sopravvivenza in condizioni di stress acido

NOTA: E. coli MG1655 DNA genomico è stato isolato utilizzando un protocollo pubblicato 21.

  1. Amplificare hdeB da E. coli MG1655 mediante PCR usando primer hdeB - BamH I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATT e hdeB - EcoR I-FW GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C.
  2. Impostare la reazione di PCR in 50 microlitri come segue: 10 microlitri di buffer 5x polimerasi, 200 micron dNTP, 0,5 micron di primer JUD2, 0,5 micron di primer JUD5, 150 ng DNA genomico MG1655, 0,5 microlitri DNA polimerasi, aggiungere DDH 2 O a 50 ml.
  3. Eseguire l'amplificazione di hdeB come segue: Fase 1: 5 min a 95 ° C, 1 ciclo; step 2: 30 sec a 95 ° C, 30 sec a 55 ° C, 30 sec a 72 ° C, 40 cicli; Fase 3: 10 min a 72 ° C.
  4. Clone risultante frammento di PCR nei siti EcoR I e BamH I del plasmide pBAD18 utilizzando metodi standard per sito di restrizione clonazione. Purificare il plasmide utilizzando un kit di purificazione plasmide secondo le istruzioni del produttore. Verificare il plasmide risultante dal sequenziamento 10.
  5. Trasformare il plasmide che esprime HdeB o le pBAD18 controllo vettoriale vuoti in ceppo BB7224 (Δ rpoH) (genotipo: F -, λ -, E14 -, [araD139] B / r [6; (ARGF-lac) 169 flhD5301 Δ (Fruk-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm R) rbsR22 Δ (fimB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 ZHF :: Tn 10 (Tc S) suhX401 deoC1 Arad + rpoH :: kan +; 16) usando le cellule chimicamente competenti.
    NOTA: Questo ceppo è sensibile alla temperatura.
  6. Dopo 45 sec shock termico a 42 ° C e prima della placcatura, incubare le cellule a 30 ° C e 200 rpm. Eseguire singola colonia striscia-out dei cloni positivi e incubare una notte a 30 ° C. Preparare una coltura durante la notte in 50 ml LB Amp e coltivare le cellule a 200 rpm e 30 ° C.
  7. Diluire culture overnight 40 volte in 25 ml LB Amp e crescere i batteri in presenza di 0,5% arabinosio (Ara) a 30 ° C e 200 rpm a un 600nm OD = 1.0 per indurre l'espressione della proteina HdeB.
  8. Per gli esperimenti variazione del pH, usare LBAmp + Ara per diluire le cellule a OD 600nm di 0,5 e regolare ai rispettivi valori di pH (qui: pH 2.0, pH 3.0 e pH 4,0) con l'aggiunta di volumi adeguati su 5 M HCl.
  9. Dopo che i punti di tempo indicato (pH 2, 1 min; pH 3, 2.5 min; pH 4, 30 min), neutralizzare gli culture aggiunta dei volumi adeguati su 5 M NaOH.
  10. Monitorare la crescita delle colture neutralizzati in coltura liquida per 12 ore a 30 ° C utilizzando misurazioni OD.

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Representative Results

HdeA e HdeB sono omologhi E. proteine coli, noto per proteggere le proteine periplasmatiche contro condizioni di stress acido 10. Il nostro lavoro ha rivelato che simile a HdeA, HdeB funziona anche come un acido attivato chaperone molecolare. Tuttavia, a differenza di funzioni HdeA, HdeB ad un pH che è ancora potenzialmente battericida, ma significativamente superiore al pH ottimale di HdeA 6,9,10,22. Per studiare il pH ottimale di attività chaperone di HdeB in vitro, nativo MDH è stato diluito in pre-riscaldato (43 ° C) di tampone del pH indicato in presenza o assenza di HdeB. Dopo 360 sec di incubazione, la reazione di incubazione è stata neutralizzata. Questa neutralizzazione innesca aggregazione di MDH a 43 ° C 9. Risultati rappresentativi mostrano che il segnale di luce-dispersione del MDH in assenza di HdeB aumenta notevolmente sulla neutralizzazione dovuta all'aggregazione di MDH (figura 1, bllinea ACK ad ogni pH). In presenza di HdeB, il segnale di luce-dispersione è significativamente diminuita upon neutralizzazione da pH 4 o pH 5 indica che HdeB impedisce l'aggregazione di MDH (figura 1, pH 4 e pH 5). Al contrario, tuttavia, sulla neutralizzazione da pH 2 e pH 3, MDH aggrega rapidamente nella stessa misura indipendente dalla presenza o assenza di HdeB (figura 1, pH 2 e pH 3), indicando che il pH ottimale per l'attività chaperone di HdeB è tra pH 4 e 5. il buffer di memorizzazione HdeB avuto alcun effetto sull'aggregazione MDH (Figura 1, controllo del buffer), indicando che il segnale di luce-dispersione ridotta MDH in presenza di HdeB a pH 4 è dovuto alla sua funzione di chaperone. HdeA è chaperone attivo nella sua forma monomerica e spiegato a pH 2-3, ma non mostra alcuna attività o superiori pH 4 10. Questi risultati suggeriscono che HdeB ha la sua attività chaperone ottimale circa pH 4 10.

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Figura 1:. Attività Chaperone di HdeB a pH acido 0,5 mM MDH stata incubata in pre-riscaldato tampone D al pH indicato in assenza o presenza di 12,5 mM HdeB per 360 sec a 43 ° C. Il pH dei campioni è stata poi portata a pH 7 (come indicato dalla asterisco) mediante aggiunta di 0,16-0,34 volume di 2 M buffer K 2 HPO 4, MDH aggregazione è stata misurata per un ulteriore 440 sec monitorando dispersione della luce a 350 nm a pH neutro (sfondo blu). Figura viene modificato da Dahl et al. 10 ricerca .Questo è stato originariamente pubblicato sul Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, salmone L, S Horowitz, Bardwell JC, funzioni Jakob U. HdeB come un chaperone acido-protettivo nei batteri. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright l'American Society for Biochimica e Biologia Molecolare.s / ftp_upload / 54527 / 54527fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Per affrontare se forme HdeB complessi stabili anche con altre proteine ​​clienti, 3 mM LDH è stato dispiegato termicamente a 41 ° C in presenza o assenza di 30 mM HdeB a differenti condizioni di pH. Analisi del comportamento sedimentazione di questi campioni di ultracentrifugazione analitica è stata condotta a 22 ° C. Quando LDH e HdeB stati incubati insieme a pH 7 e 41 ° C, LDH rimasta esclusivamente tetramerica (peso molecolare di 120 kDa) e HdeB rimasto dimerica. Questi risultati indicano che le proteine non formano complessi stabili a pH 7, e LDH non subiscono cambiamenti irreversibili oligomerizzazione upon a 20 min di incubazione a 41 ° C (figura 2, linea verde). Analogamente, HdeB rimasto dimerica upon incubazione a 41 ° C e pH 4,0, indicando che l'incubazione pH bassodi HdeB non influenza il suo stato di oligomerizzazione anche in condizioni da shock termico (Figura 2, linea rossa). LDH quando incubato a pH 4 e 41 ° C in assenza di HdeB rapidamente aggregati come indicato dal fatto che il 40% di LDH sedimentato prima della prima scansione è stata registrata (figura 2, indicato nell'angolo superiore destro). La LDH restante sembrava sedimentare prevalentemente come monomero (figura 2, linea blu). Al contrario, l'incubazione di LDH e HdeB a pH 4 e 41 ° C causato gran parte delle due proteine di co-sedimenti (HdeB-LDH C), formando una nuova specie con peso molecolare di 134 kDa. Questa specie probabilmente rappresenta un complesso tra dimeri HdeB e LDH svolgimento termicamente. Inoltre, in presenza di HdeB, è stata osservata alcuna significativa aggregazione LDH prima della sedimentazione, che è coerente con le nostre misurazioni aggregazione in vitro. Questi risultati dimostrano che HdeB mostra un'attività chaperone nel suoforma dimerica a pH 4.0. Questo è in netto contrasto con HdeA, che è chaperone attivo nella sua forma monomerica. La natura dinamica della HdeB che gli permette di subire riarrangiamenti strutturali tra pH 4 e pH 7 è probabile sufficiente per l'attivazione della funzione di chaperone di HdeB 10.

figura 2
Figura 2:. Rilevamento di formazione del complesso tra HdeB e LDH dispiegata a pH 4 mediante ultracentrifugazione analitica 3 LDH mM è stata incubata in presenza di un 10-eccesso molare HdeB in tampone D (150 mM KHPO 4, 150 mM NaCl) per 15 min a 41 ° C sia a pH 7 (linea verde) o pH 4 (linea nera). Per confronto, LDH alone (linea blu) o da solo HdeB (linea rossa) sono state incubate per 15 min a 41 ° C a pH 4. velocità ultracentrifugazione sedimentazione analitica è stata utilizzata per determinare la stechiometria HdeB, LDH, e il complesso formano tra HdeB e LDH a difcondizioni di pH ferenti. Notare che ~ 40% LDH aggregate prima della prima scansione quando incubato a pH 4 e in assenza di HdeB (come indicato nell'angolo superiore destro). Viene mostrato un diagramma di distribuzione coefficiente di sedimentazione (c (s)) ha analizzato utilizzando il SEDFIT programma. Le lettere indicano il rispettivo stato oligomerico di LDH o HdeB rispettivamente: HdeB D, HdeB dimero; LDH M, LDH monomero, LDH T, LDH tetramero; HdeB-LDH C, complesso HdeB-LDH. Figura viene modificato da Dahl et al. 10. Questa ricerca è stato originariamente pubblicato nel Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, salmone L, S Horowitz, Bardwell JC, funzioni Jakob U. HdeB come un chaperone acido-protettivo nei batteri. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright l'American Society for Biochimica e Biologia Molecolare. Cliccate qui per visualizzare un grande versione di questa figura.

Per verificare se HdeB sostiene il ripiegamento delle proteine ​​clienti su neutralizzazione, l'influenza di HdeB sul ripiegamento di MDH pH-denaturato è stato analizzato. Termicamente denaturato MDH stata incubata a diversi valori di pH in presenza o assenza di HdeB. Dopo l'incubazione a basso pH, il pH è stato neutralizzato (che avvia MDH ripiegamento), e l'attività MDH è stata determinata dopo 2 ore. Come mostrato in figura 3, significativa riattivazione di MDH stato ottenuto su neutralizzazione da pH 4 in presenza di HdeB. Nessuna attività è stata determinata MDH quando HdeB era assente dal incubazione basso pH.

Figura 3
Figura 3: HdeB facilita il ripiegamento di acido denaturata MDH a uno stato enzimaticamente attivo 1 mM MDH è stato incubato in tampone D al pH indicato per 1 ora a 37 ° C in assenza o p.RESENZA di 25 micron HdeB. Poi, la temperatura è stata spostata a 20 ° C per 10 minuti prima che i campioni sono stati neutralizzati a pH 7 mediante aggiunta di 0,5 M Na 2 HPO 4. Aliquote sono state effettuate dopo 2 h di incubazione a 20 ° C e saggiate per l'attività MDH. è mostrato attività MDH sulla neutralizzazione in assenza (barre bianche) o presenza di HdeB (barre nere). è mostrato Deviazione standard derivato da almeno 3 misurazioni indipendenti. Figura viene modificato da Dahl et al. 10. Questa ricerca è stato originariamente pubblicato nel Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, salmone L, S Horowitz, Bardwell JC, funzioni Jakob U. HdeB come un chaperone acido-protettivo nei batteri. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright l'American Society for Biochimica e Biologia Molecolare. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questafigura.

I nostri dati in vitro hanno rivelato che HdeB lega diverse proteine client modello a pH 4, impedisce la loro aggregazione e facilita cliente ripiegamento condizioni di pH neutro, una volta vengono ripristinati. Per studiare gli effetti di HdeB in vivo, test di sopravvivenza pH-dipendenti sono stati condotti utilizzando la sensibile alla temperatura rpoH eliminazione ceppo. Questo ceppo manca la maggior parte degli accompagnatori ed è quindi più suscettibile a temperatura elevata, basso pH o stress ossidativo 15. Sovraespressione di HdeB in condizioni di pH neutro non ha mostrato alcun effetto sul tasso di crescita del ceppo, che è cresciuto relativamente bene al ceppo di controllo che ospita il pBAD18 vettore vuoto (Figura 4, non trattato). Al contrario, abbiamo riscontrato evidenti differenze nella loro capacità di riprendere la crescita su pH 3 o pH 4 trattamento con il ceppo iperespressione HdeB mostrando riproducibile migliorato recupero dal basso pH treaTIMENTO rispetto al ceppo di controllo. In contrasto con i nostri dati in vitro, tuttavia, la presenza di HdeB ha avuto un effetto significativo protettivo a pH 3. Questo potrebbe essere dovuto alla elevata concentrazione di HdeB nella cellula, che potrebbe spostare lo stato oligomerizzazione di HdeB verso dimeri anche a pH 3. si noti che spostando le cellule a pH 2 o 3 pH ha provocato effetti molto veloce e altamente tossici, mentre è stata osservata alcuna uccisione significativa quando le cellule in cui incubate a pH 4 9,10,22.

Figura 4
Figura 4: HdeB protegge E. coli contro pH acido. HdeB (cerchi rossi) è stato overexpressed in BB7224 (Δ rpoH) in presenza di 0,5% arabinosio a 30 ° C. cellule BB7224 che ospitano le pBAD18 vuoto vettore sono stati utilizzati come controllo (cerchi neri). Pannello superiore sinistra mostra una crescita di entrambi stpiogge a 30 ° C, pH 7. Le cellule sono spostati a pH indicato aggiungendo 5 M HCl, e incubate per 1 min a pH 2 (pannello superiore destro), 2,5 min a pH 3 (pannello inferiore sinistro) o 30 min a pH 4 (abbassare pannello di destra). Successivamente, colture sono state neutralizzate con l'aggiunta di volumi adeguati su 5 M NaOH e la crescita è stata monitorata in mezzi liquidi a 30 ° C. Figura viene modificato da Dahl et al. 10. Questa ricerca è stato originariamente pubblicato nel Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, salmone L, S Horowitz, Bardwell JC, funzioni Jakob U. HdeB come un chaperone acido-protettivo nei batteri. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright l'American Society for Biochimica e Biologia Molecolare. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Per studiare il meccanismo di attivazione e funzione chaperone di HdeB, grandi quantità di HdeB devono essere espresse e purificate. Un certo numero di sistemi di vettori di espressione sono disponibili per la produzione di alti livelli di una proteina bersaglio, comprese PTRC o pBAD vettori, entrambi i quali sono stati utilizzati in questo studio. I promotori sono facilmente accessibili per E. coli RNA polimerasi e l'espressione permettere così fortemente upregulated di HdeB in qualsiasi E. coli. Questo aspetto è particolarmente rilevante per lo studio in vivo sovraespressione di HdeB in condizioni di stress acido, in cui è stato utilizzato il ceppo -carente rpoH. Questo ceppo manca la maggior parte degli accompagnatori e, quindi, è più sensibile verso i vari fattori di stress, tra cui elevata temperatura, pH basso e lo stress ossidativo 15. In alternativa, la sopravvivenza studia simili a quelle presentate qui può essere effettuata in ceppi mutanti che mancano del gene di interesse.

t "> Il disegno sperimentale per qualsiasi attività chaperone o saggio ripiegamento deve essere considerato con attenzione, sia per quanto riguarda il tipo di cliente, la concentrazione della proteina cliente e il buffer condizioni. Nei saggi chaperone tipici, proteine ​​clienti del modello, come ad esempio citrato sintasi, luciferasi, o malato deidrogenasi sono denaturate in alte concentrazioni di urea o guanidina-HCl e diluiti nel buffer senza denaturante per indurre l'aggregazione 23,13. Misure in presenza di accompagnatori rivelano la misura in cui impediscono l'aggregazione delle proteine. in alternativa, i clienti sono termicamente spiegato ed aggregazione proteica è monitorato. in entrambi i casi, le misurazioni di dispersione della luce sono utilizzati come lettura per aggregazione proteica. chaperone attivi impediscono l'aggregazione di dispiegamento proteine clienti, provocando una diminuzione del segnale di dispersione della luce 6. entrambi di questi apparati sperimentali può essere combinato con un basso pH incubazione. Oltre a valutare il molattività di chaperone ecular monitorando la loro capacità di prevenire l'aggregazione di particolari proteine clienti, l'influenza di accompagnatori in ripiegamento cliente al ritorno a condizioni di stress non può essere testato 24. Questo è particolarmente semplice quando le proteine ​​clienti possiedono attività enzimatica, che può essere utilizzato come lettura quantitativa per la loro inattivazione e la riattivazione. Mentre ripiegamento chaperone-mediata è naturalmente un processo ATP-dipendente, accompagnatori periplasmatiche quali HdeA, HdeB e Spy hanno dimostrato di facilitare il cliente ripiegamento in maniera ATP-indipendente, in linea con la mancanza di energia nel periplasma 9,25.

Studiando il pH ottimale di un chaperone acido protettivo come HdeB è difficile a causa di vari motivi: (i) i comportamenti di aggregazione di proteine ​​chaperone-client, anche consolidati, come citrato sintasi differiscono a pH acido; e (ii) solo pochi sistemi tampone funzionano nell'intervallo di pH compreso tra 2-5 e sono suitavolo sia per il chaperone di interesse e la proteina client. Abbiamo deciso di usare tampone fosfato, anche se siamo consapevoli che questo è un sistema di buffer non ideale in condizioni di pH acido. Tuttavia, tampone fosfato è risultato essere molto adatto per caratterizzare HdeA come acido chaperone attivato 9,22. misure di aggregazione sono molto sensibili ai cambiamenti nel contenuto di temperatura o del buffer. Per eliminare i risultati falsi positivi, si consiglia quindi di verificare sempre l'influenza del buffer di stoccaggio chaperone sull'aggregazione client (figura 1, il controllo del buffer). A volte l'aggregazione della proteina cliente avviene così velocemente che anche il miglior chaperone potrebbe non essere in grado di competere con il processo di aggregazione. È pertanto indispensabile effettuare prove preliminari di trovare le condizioni di analisi ottimali. Un buon esempio di tale situazione è dato nei nostri esperimenti ultracentrifugazione dove incubazione di LDH a temperature> 42 ° C è così veloce che anche lapresenza di un eccesso di HdeB non impedisce l'aggregazione LDH. Inoltre, il / co-chaperone rapporto chaperone o il rapporto chaperone / cliente deve essere determinato con cura 23. Abbiamo iniziato con un abbastanza alto HdeB: rapporto MDH di 50: 1 in esperimenti preliminari e che ci ha aiutato a identificare pH 4 come il pH ottimale per l'attività di chaperone HdeB. Abbiamo poi continuato analizzando HdeB: rapporti MDH tra 1: 1 e 50: 1 a pH 4, identificando 25: 1 per essere il rapporto più efficace. Al contrario, HdeA soppressa MDH aggregazione come 10: 1 chaperone: rapporti client 6,9,10,22. Quindi, possiamo concludere che HdeA, in confronto a HdeB, è più efficace nel sopprimere l'aggregazione MDH come chaperone inferiore: i rapporti del cliente sono stati sufficienti per sopprimere completamente MDH aggregazione. Un altro approccio per indagare soppressione chaperone-mediata di aggregazione proteica comporta saggi di spin-down, in cui gli aggregati client vengono rimossi per centrifugazione e quantificate mediante SDS PAGE. Questo approccio è adatto anche per il mONITORAGGIO l'influenza di accompagnatori su aggregazione proteica in vivo. ceppi mutanti che o iperesprimono o la mancanza chaperone di interesse sono esposti a proteine ​​dispiegarsi condizioni di stress. Successivamente, le cellule sono lisate e frazioni solubili e aggregati sono separati e quantificati 15,16,26.

Per il rilevamento del complesso client-chaperone, abbiamo applicato ultracentrifugazione analitica. Si deve notare qui che sulla base della configurazione sperimentale non è possibile quantificare direttamente la quantità di HdeB e monomeri LDH vincolato in questo complesso, come entrambe le proteine ​​assorbono a 280 nm. Se desiderato, la stechiometria del complesso chaperone-client può essere determinata mediante l'etichettatura separatamente chaperone e proteine ​​cliente con un cromoforo, la cui eccitazione massima è compreso nel campo visibile. In alternativa, la stechiometria clienti di chaperone entro complessi può essere determinato utilizzando PAGE nativa accoppiato con western blot quantitativa. Seguendo i protocolli qui presentati, siamo stati in grado di caratterizzare due chaperon molecolari, HdeA, e HdeB 9,10,22. In generale, questi test possono essere utilizzati anche per studiare il ruolo di potenziali inibitori di chaperone molecolari ripiegamento di proteine in vitro e in vivo o possono essere applicate per testare accompagnatori sintetici per la loro capacità di prevenire l'aggregazione client sotto stress acido. Inoltre, i protocolli qui presentati possono essere utilizzati per analisi di mutazioni puntiformi e / o varianti tronche degli accompagnatori acido attivato al fine di far luce nel meccanismo della loro attivazione.

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Acknowledgments

Ringraziamo il Dr. Claudia Cremers per lei consigli utili su saggi chaperone. Ken Wan è riconosciuto per la sua assistenza tecnica nella purificazione HdeB. Questo lavoro è stato sostenuto dal Howard Hughes Medical Institute (a JCAB) e il National Institutes of Health sovvenzione RO1 GM102829 a JCAB e Ujj-UD è supportato da una borsa di ricerca post-dottorato fornita dalla German Research Foundation (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NEB10-beta E. coli cells New England Biolabs C3019I
Ampicillin Gold Biotechnology A-301-3
LB Broth mix, Lennox LAB Express 3003
IPTG Gold Biotechnology I2481C50
Sodium chloride Fisher Scientific S271-10
Tris Amresco 0826-5kg
EDTA Fisher Scientific BP120-500
Polymyxin B sulfate  ICN Biomedicals Inc. 100565
0.2 µm pore sterile Syringe Filter Corning 431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml) GE Healthcare Life Sciences 17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15% Bio-Rad 4561046
Malate dehydrogenase (MDH) Roche 10127914001
Potassium phosphate (Monobasic) Fisher Scientific BP362-500
Potassium phosphate (Dibasic) Fisher Scientific BP363-1
F-4500 fluorescence spectrophotometer Hitachi FL25
Oxaloacetate Sigma O4126-5G
NADH Sigma  N8129-100MG
Sodium phosphate monobasic Sigma  S9390-2.5KG
Sodium phosphate dibasic Sigma  S397-500
Lactate dehydrogenase (LDH) Roche 10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge Beckman Coulter 392764
Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled Beckman Coulter 306493
AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place Beckman Coulter 363782
Wizard Plus Miniprep Kit Promega A1470 used for plasmid purification (Protocol 5.1)
L-arabinose Gold Biotechnology A-300-500
Glycine DOT Scientific Inc DSG36050-1000
Fluorescence Cell cuvette Hellma Analytics 119004F-10-40
Oligonucleotides Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0530S
dNTP set Invitrogen 10297018
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-212
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL Millipore UFC900324
Centrifuge Avanti J-26XPI Beckman Coulter 393127
Varian Cary 50 spectrophotometer Agilent Tech
Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa Spectrum Laboratories 132650
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K Millipore UFC803024
SDS Fisher Scientific bp166-500
Veriti 96-Well Thermal Cycler Thermo Fisher 4375786

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References

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Rilevamento del pH-dipendente attività di<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; e<em&gt; In Vivo</em
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Dahl, J. U., Koldewey, P., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (116), e54527, doi:10.3791/54527 (2016).

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