Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Detektering av den pH-beroende aktivitet för Published: October 23, 2016 doi: 10.3791/54527
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan, 2Howard Hughes Medical Institute, University of Michigan

Summary

Denna studie beskriver biofysiska, biokemiska och molekylära tekniker för att karakterisera chaperone aktiviteten hos Escherichia coli HdeB under sura pH-betingelser. Dessa metoder har tillämpats med framgång för andra syraskydds chaperoner såsom HdeA och kan modifieras för att fungera för andra chaperoner och stressförhållanden.

Abstract

Bakterier utsätts ofta för miljöförändringar, såsom förändringar i pH, temperatur, redox-status, ljusexponering eller mekanisk kraft. Många av dessa förhållanden ge protein utspelas i cellen och har negativ inverkan på överlevnaden av organismen. En grupp av obesläktade, stressspecifika molekylära kaperoner har visats spela viktiga roller i överlevnaden av dessa stressförhållanden. Medan helt vikta och förkläde-inaktiv innan stress, dessa proteiner snabbt utvecklas och bli förkläde aktiva under specifika stressförhållanden. När den är aktiverad, dessa villkorligt oordnade chaperoner binda till ett stort antal olika aggregering benägna proteiner, förhindra deras aggregering och antingen direkt eller indirekt underlätta proteinåterveckning efter återkomsten till icke-påfrestningar. Den primära metoden för att få en mer detaljerad förståelse om mekanismen för deras aktivering och klient erkännande innebär rening och subsequent karakterisering av dessa proteiner med användning av in vitro-eskorte analyser. Uppföljning in vivo spänningsanalyser är absolut nödvändigt att självständigt bekräfta erhållna in vitro resultat.

Detta protokoll beskriver in vitro och in vivo-metoder för att karakterisera kaperonet aktiviteten för E. coli HdeB, en syraaktiverad chaperone. Ljusmätningar Spridnings användes som en bekväm avläsning för HdeB förmåga att förhindra syra-inducerad aggregation av en etablerad modell klient protein, MDH, in vitro. Analytiska ultracentrifugeringsexperiment applicerades för att avslöja komplexbildning mellan HdeB och dess klient protein LDH, att bringa klarhet i vad som händer med klient proteiner när de återvänder till icke-påfrestningar. Enzymatiska aktivitetsanalyser av klient proteinerna utfördes för att övervaka effekterna av HdeB på pH-inducerad klient inaktivering och reaktivering. Slutligen har studier överlevnads används för att monitor påverkan av HdeB s chaperonfunktion in vivo.

Introduction

En vanlig naturliga miljö där mikrobiella patogener upplever syra-inducerade protein utspelas villkor är däggdjur magen (pH-område 1-4), vars surt pH fungerar som en effektiv barriär mot livsmedelsburna patogener 1. Protein utbredning och aggregation, som orsakas av aminosyrasidokedjan protone påverkar biologiska processer, skadar cellstrukturer och slutligen orsakar celldöd 1,2. Sedan pH-värdet hos den bakteriella periplasman i jämvikt nästan ögonblickligen med miljö pH på grund av den fria diffusionen av protoner genom det porösa yttre membranet, periplasmiska och inre membranproteiner av Gram-negativa bakterier är de mest sårbara cellulära komponenter under syrastressbetingelser 3. För att skydda deras periplasmatiska proteomet mot snabb syra-medierad skada, gramnegativa bakterier utnyttjar syraaktiverade periplasmiska chaperoner HdeA och HdeB. HdeA är ett villkorligt störda kaperon 6,7. Aktivering av HdeA kräver omfattande strukturförändringar, inklusive dess dissociation i monomerer, och den partiella utspelas monomerer 6-8. När den är aktiverad, binder HdeA till proteiner som utvecklas under sura betingelser. Det förhindrar effektivt deras sammanläggning både under inkubation vid lågt pH samt på pH neutralisering. Efter återkomst till pH 7,0, HdeA underlättar veckningen av dess klient proteiner i en ATP-oberoende sätt och omvandlar tillbaka till sin dimer, chaperon-inaktiv konforma 9. På liknande sätt är den homologa chaperone HdeB också chaperon-inaktiv vid pH 7,0. Till skillnad från HdeA dock HdeB s förkläde aktivitet når sin skenbara maximum vid pH 4,0, under vilka förutsättningar HdeB är fortfarande till stor del viks och dimera 10. Dessutom ytterligare sänkning av pH causes inaktivering av HdeB. Dessa resultat tyder på att trots deras omfattande homologi, HdeA och HdeB skiljer sig i deras sätt att funktionell aktivering ger dem möjlighet att täcka ett brett pH-intervall med deras skyddande förkläde funktion. En andra chaperon som har varit inblandad i syrabeständigheten hos E. coli är den cytoplasmatiska Hsp31, som verkar för att stabilisera ovikta klient proteiner tills neutrala förhållanden har återställts. Den exakta verk Hsp31 åtgärder har dock förblivit gåtfulla 12. Med tanke på att andra enteropatogena bakterier såsom Salmonella saknar hdeAB operonet, är det mycket troligt att andra ännu oidentifierade periplasmiska kaperoner kan finnas som är involverade i syrabeständigheten hos dessa bakterier 11.

De protokoll som presenteras här gör det möjligt att övervaka pH-beroende chaperon aktiviteten av HdeB in vitro och in vivo 10 och kan tillämpas för att undersöka andra kaperonersåsom Hsp31. Alternativt kan det komplexa nätverket av transkriptionsfaktorer som styr uttrycket av hdeAB potentiellt undersökas av vivo spänningstest på. För att karakterisera chaperonfunktion av proteiner in vivo, kan olika experimentella uppställningar tillämpas. En väg är att tillämpa protein utspelas spänningsförhållanden och fenotypiskt karakterisera mutantstammar som antingen överuttrycker genen av intresse eller bär en deletion av genen. Proteomikstudier kan utföras för att identifiera vilka proteiner inte längre aggregat under stressförhållanden när kaperonet är närvarande, eller påverkan av en förkläde på ett specifikt enzym kan bestämmas under stressförhållanden med användning av enzymatiska analyser 14-16. I denna studie valde vi att överuttrycka HdeB i en rpoH deletionsstam, som saknar värmechockssigmafaktorn 32. rpoH kontrollerar uttrycket av samtliga större E. coli chaperoner och dess deletion är känt för att öka sensitivity miljöstresstillstånd som orsakar protein utspelas 15. In vivo chaperon aktivitet hos HdeB bestämdes genom att övervaka dess förmåga att undertrycka pH-känsligheten hos Δ rpoH stam. Helt och hållet, de protokoll som presenteras här ger en snabb och enkel metod för att karaktärisera aktiviteten av en syraaktiverad kaperon in vitro såväl som i in vivo sammanhang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Expression och rening av periplasmiska HdeB

OBS: HdeB uttrycktes i E. coli-celler som hyser plasmiden pTrc- hdeB 10, och renades från periplasman vid polymyxin lys.

  1. Förbereda en över natten kultur av E. coli-celler som hyser plasmiden pTrc- hdeB 10 i 30 ml LB innehållande 200 ug / ml ampicillin (LB Amp). Inokulera fyra 1 L kulturer av LB Amp och odla dem vid 37 ° C och 200 rpm tills OD 600 nm av 0,7 har uppnåtts. Därefter, tillsätt 300 | iM IPTG för att inducera uttryck av HdeB och minska tillväxttemperaturen till 30 ° C.
  2. Efter 5 h av proteinuttryck vid 30 ° C, skörda cellerna genom centrifugering vid 8000 xg under 5 min vid 4 ° C.
  3. Tvätta cellpelleten med 100 ml buffert A (50 mM Tris / HCl, 50 mM NaCl, pH 7,5) och centrifugera cellerna igen vid 8000 xg under 5 min vid 4 ° C.
  4. Därefter resuspenderacellpelleten i 80 ml buffert A, innehållande 1 mg / ml polymyxin sulfat. För effektiv sönderdelning av det yttre membranet, försiktigt röra om suspensionen under 1 timme vid 4 ° C.
  5. För att avlägsna den cytoplasmatiska fraktionen och cellrester, centrifugera suspensionen under 20 min vid 15000 xg vid 4 ° C. Detta resulterar i ~ 60 ml supernatanten innehållande den lösliga HdeB.
  6. Dialysera supernatanten innehållande det periplasmatiska extraktet över natt mot 150x volym av buffert B (20 mM Tris / HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8,0) med användning av ett dialysmembran med 6 kDa MW cut-off. Koncentrera proteinerna till 15 ml med användning av centrifugala filterenheter med en molekylviktsgräns av 3 kDa. Filtrera proteinlösningen med användning av en 0,2 | im por-filter.
  7. Applicera proteinet på en anjonbytar-kromatografikolonn (kolonnvolym 5 ml) som har jämviktats med 5 kolonnvolymer buffert B med en flödeshastighet av 2,5 ml / min. När proteinet laddades på kolonnen, tvätta kolonnen med buffert B under 10 min viden flödeshastighet av 2,5 ml / min. Eluera HdeB med en linjär gradient från 0 till 0,5 M NaCl i buffert B under en tidsperiod av 50 min med en flödeshastighet av 2,5 ml / min 6.
  8. Identifiera fraktioner innehållande HdeB med användning av en 15% SDS-PAGE. Blanda 20 | il prov med 5 | j, l 5x reducerad SDS-laddningsbuffert. Belastning 10 pl på gelén och körs i Tris-glycinbuffert (14,4 g / L glycin, 2,9 g / L Tris, 1 g / L natriumdodecylsulfat, pH 8,3). Kör gelén vid 150 V tills bromfenol bandet har migrerat nära botten av gelén (~ 45 min).
  9. Pool alla HdeB-innehållande fraktioner, dialysera vid 4 ° C över natt mot 4 L HdeB lagringsbuffert (50 mM Tris / HCl, 200 mM NaCl, pH 8,0), och koncentrera proteinet till ca 300 | iM med användning av centrifugala filterenheter med en molekylvikt cut-off 3 kDa. Bestämma koncentrationen av HdeB vid 280 nm med användning av extinktionskoefficienten ε 280 nm = 15595 M -1 cm -1. Bereda 100 | il alikvoter och flash-frize de alikvoter i flytande kväve.
    OBS: HdeB kan lagras vid -70 ° C under minst 6 månader.

2. Chaperone Aktivitetsanalys Använda Termiskt Unfolding malatdehydrogenas (MDH)

OBS: Inverkan av renade HdeB om sammanläggning av termiskt utspelas porcint mitokondriell malatdehydrogenas (MDH) vid olika pH-värden övervakades såsom beskrivs nedan. Produkterna på listan proteinkoncentrationer avser monomerkoncentrationen.

  1. För att framställa MDH, dialyze MDH vid 4 ° C över natt mot 4 L buffert C (50 mM kaliumfosfat, 50 mM NaCl, pH 7,5) och koncentrera proteinet till ca 100 | iM med användning av centrifugala filterenheter med en molekylviktsgräns av 30 kDa.
    OBS: Noggrann dialys av MDH krävs som MDH levereras som ammoniumsulfatlösning.
  2. För att avlägsna aggregat, centrifugera proteinet under 20 minuter vid 20.000 xg vid 4 ° C. Bestämma MDH koncentration genom absorbans vid 280 nm (ε <sub> 280 nm = 7.950 M -1 cm -1). Förbered 50 l alikvoter av MDH och flash-frysa portioner för lagring.
  3. Placera en ml kvartskuvett i en fluorescensspektrofotometer utrustad med temperaturstyrda provhållare och omrörare. Ställ λ ex / em till 350 nm.
  4. Lägga lämpliga volymer av förvärmda (43 ° C) buffert D (150 mM kaliumfosfat, 150 mM NaCl) vid de önskade pH-värden (här: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0, och pH 5,0) till kyvetten och uppsättningen temperaturen i kyvetthållaren till 43 ° C. Den totala volymen är 1000 il.
  5. Lägga 12,5 pM HdeB (eller alternativt samma volym av HdeB lagringsbuffert för buffertkontrollen) till bufferten, följt av tillsats av 0,5 | iM MDH. Börja övervaka ljusspridning. Inkubera reaktionen för 360 sek för att ge tillräcklig utvecklandet av MDH.
  6. Höja pH till 7 genom tillsats av från 0,16 till 0,34 volym av 2 M obuffrad K 2 HPO 4 och fortsätta religt ljusspridning för en annan 440 sek.
  7. Ställ in graden av MDH aggregering som registreras i frånvaro av kaperon vid en definierad tidpunkt efter neutralisering (här efter 500 sekunder, när maximal ljusspridning av MDH observerades) till 100%. Normalisera HdeB aktivitet till ljusspridningssignalen av MDH i frånvaro av HdeB vid varje indikerade pH-värdet.

3. Detektion av HdeB-LDH komplexbildning av Analytical Ultracentrifugering (AUC)

OBS: Sedimenteringshastighets experiment HdeB ensamt eller i komplex med termiskt utspelas laktatdehydrogenas (LDH) utfördes med användning av en analytisk ultracentrifug.

  1. För att framställa LDH, dialyze LDH vid 4 ° C över natt mot 4 L buffert C (50 mM kaliumfosfat, 50 mM NaCl, pH 7,5) och koncentrera proteinet till ca 200 | iM med användning av centrifugala filterenheter med en molekylviktsgräns av 30 kDa.
    OBS: Noggrann dialys av LDH krävs som LDH levereras som ammoniumsulfatlösning.
  2. För att ta bort aggregat, centrifug LDH under 20 minuter vid 20.000 xg vid 4 ° C. Bestämma LDH koncentration genom absorbans vid 280 nm (ε 280 nm = 43680 M -1 cm -1). Förbered 50 l alikvoter av LDH och flash-frysa portioner för lagring.
  3. Inkubera 3 pM LDH i närvaro och frånvaro av 30 pM HdeB i buffert D (pH 4 och 7, respektive) under 15 min vid 41 ° C.
    OBS: Inkubation av LDH vid högre temperaturer resulterar i dess fullständiga aggregering, och ingen chaperone effekten av HdeB kan observeras.
  4. Låt proverna svalna till rumstemperatur. Sedan lastprover i celler som innehåller standardsektorformade 2-kanals center med 1,2 cm väglängd. Ladda cellerna in i ultracentrifug och jämvikt till 22 ° C under åtminstone 1 h före sedimentering.
  5. Spin prover vid 22 ° C och 167 tusen xg i respektive rotorn under 12 timmar, och övervaka sedimentation av proteinet kontinuerligt vid 280 nm. Såsom tidigare visats, är signal-brusförhållandet förbättras när den överförda ljusintensiteten hos varje kanal mäts snarare än absorbansen. Detta förbättrar också kvaliteten på efterföljande data montering.
  6. Genomför dataanalys med SEDFIT (version 15.01b december 2015), med hjälp av den kontinuerliga c (s) distributionsmodell 17. En handledning som beskriver hur man använder SEDFIT kan hittas i 18 referens.
    1. Ställ konfidensnivån för ME (Maximum Entropy) reglering till 0,7.
  7. Beräkna buffertdensitet liksom viskositeten med hjälp av SEDNTERP 19. För att uppskatta mängden aggregerad klient protein, jämföra integralerna av sediment LDH i pH 4 till pH 7 som referens.
    OBS: Integrering av sedimenteringsdistributions tomter kan göras direkt i SEDFIT. Alternativ programvara för att analysera sedimentehastighetsdata kan hittas i en senaste omdömet 20. </ Li>

4. Övervakning MDH inaktivering och reaktivering i närvaro av HdeB

OBS: Inverkan av renade HdeB på återvikning av pH-ovikt MDH bestämdes genom övervakning av MDH aktivitet vid neutralisation.

  1. Inkubera 1 pM MDH i buffert D vid de önskade pH-värden (här: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0, och pH 5,0) under 1 h vid 37 ° C i frånvaro eller närvaro av 25 | iM HdeB. Då, skifta temperaturen till 20 ° C under 10 min.
    OBS: Inget MDH återvikning observerades även i närvaro av HdeB när MDH inkuberades vid temperaturer högre än 37 ° C.
  2. För att initiera återvikning av syra denaturerad MDH, neutralisera proverna till pH 7 genom tillsats av 0,13 till 0,42 volym av 0,5 M natriumfosfat, pH 8,0.
  3. Efter inkubation under 2 h vid 20 ° C, fastställa MDH-aktivitet genom att övervaka minskningen av NADH vid 340 nm 9.
    OBS: MDH katalyserar NADH-beroende reduktion av oxalacetat till L-malat. Blanda 50 | il av inkubationen reaktionen med 950 | il av analysbuffert (50 mM natriumfosfat, pH 8,0, 1 mM oxaloacetat, och 150 ^ iM NADH).
    OBS: Den slutliga koncentrationen av MDH i analysbufferten bör vara 44 nM.
  4. Övervaka förändringen i absorbans med användning av en spektrofotometer, utrustad med en Peltier temperaturstyrblock inställt på 20 ° C.
  5. Rapportera MDH aktivitet i förhållande till 44 nM infödda MDH som har hållits vid pH 7,0.

5. Effekt av HdeB Uttryck på E. coli överlevnad under sura Stress

OBS: E. coli MG1655 iskt DNA isolerades med användning av ett publicerat protokoll 21.

  1. Amplifiera hdeB från E. coli MG1655 genom PCR med användning av primers hdeB - BamH I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATT och hdeB - EcoR I-fw GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C.
  2. Ställ in PCR-reaktionen i 50 ^ enligt följande: 10 ul 5x polymerasbuffert, 200 ^ M dNTP, 0,5 ^ M primer JUD2, 0,5 | iM primer JUD5, 150 ng genomiskt DNA MG1655, 0,5 pl DNA-polymeras, till DDH 2 O till 50 pl.
  3. Utföra amplifiering av hdeB enligt följande: Steg 1: 5 min vid 95 ° C, 1 cykel; steg 2: 30 sek vid 95 ° C, 30 sek vid 55 ° C, 30 sek vid 72 ° C, 40 cykler; Steg 3: 10 min vid 72 ° C.
  4. Klon resulterande PCR-fragment in i EcoR I och BamH I-sätena av plasmid pBAD18 med användning av standardmetoder för restriktionsställe kloning. Rena plasmiden med användning av en plasmid-reningskit enligt tillverkarens instruktioner. Kontrollera den resulterande plasmiden genom sekvensering 10.
  5. Omvandla plasmiden uttrycker HdeB eller tom vektor kontroll pBAD18 i stammen BB7224 (Δ rpoH) (genotyp: F -, λ -, E14 - [araD139] B / R [6, (argF-lac) 169 flhD5301 Δ (fruK-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm R) rbsR22 Δ (FIMB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 ZHF :: Tn 10 (Tc S) suhX401 deoC1 araD + rpoH :: kan-+; 16) med användning av kemiskt kompetenta celler.
    OBS: Denna stam är temperaturkänslig.
  6. Efter 45 sek värmechock vid 42 ° C och före plätering, inkubera cellerna vid 30 ° C och 200 rpm. Utför enda koloni streak-outs av de positiva klonerna och inkubera över natten vid 30 ° C. Förbereda en över natten kultur i 50 ml LB-Amp och odla cellerna vid 200 rpm och 30 ° C.
  7. Späd övernattskulturer 40-faldigt i 25 ml LB-Amp och växa bakterierna i närvaro av 0,5% arabinos (Ara) vid 30 ° C och 200 rpm till en OD 600nm = 1,0 för att inducera HdeB proteinuttryck.
  8. För pH skiftexperiment använder LBAmp + Ara att späda cellerna till OD 600 nm av 0,5 och anpassa sig till de respektive pH-värden (här: pH 2,0, pH 3,0 och pH 4,0) genom tillsats av lämpliga volymer av 5 M HCl.
  9. Efter de angivna tidpunkterna (pH 2, 1 min; pH 3, 2,5 min; pH 4, 30 min), neutralisera odlingarna genom tillsats av lämpliga volymer av 5 M NaOH.
  10. Följa tillväxten av de neutraliserade kulturerna i flytande odling under 12 h vid 30 ° C med användning av OD-mätningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HdeA och HdeB är homologa E. coli-proteiner, som är kända för att skydda periplasmatiska proteiner mot sura stressförhållanden 10. Vårt arbete visar att liknande HdeA, HdeB fungerar också som en syra aktiverad molekylära förkläde. Men i motsats till HdeA, HdeB funktioner vid ett pH som fortfarande potentiellt baktericid, men betydligt högre än pH-optimum för HdeA 6,9,10,22. För att undersöka pH-optimum för HdeB s chaperon-aktivitet in vitro, var nativt MDH späddes i förvärmda (43 ° C) buffert med det indikerade pH i närvaro eller frånvaro av HdeB. Efter 360 sek av inkubering inkubering reaktionen neutraliseras. Denna neutralisering utlöser aggregering av MDH vid 43 ° C 9. Representativa resultat visar att den ljusspridande signal av MDH i frånvaro av HdeB ökar dramatiskt vid neutralisation till följd av aggregation av MDH (figur 1, black linje vid varje pH). I närvaro av HdeB är ljusspridande signalen minskade signifikant vid neutralisation från pH 4 eller pH 5 vilket indikerar att HdeB förhindrar aggregationen av MDH (figur 1, pH 4 och pH 5). I kontrast däremot, vid neutralisation från pH 2 och pH 3, MDH aggregerar snabbt i samma utsträckning oberoende av närvaron eller frånvaron av HdeB (figur 1, pH 2 och pH 3), vilket indikerar att pH-optimum för HdeB s chaperone aktivitet är mellan pH 4 och 5. bufferten den HdeB lagring hade ingen effekt på MDH aggregation (Figur 1, buffertkontroll), vilket indikerar att den reducerade ljusspridande signal av MDH i närvaro av HdeB vid pH 4 beror på dess chaperonfunktion. HdeA är Chaperone aktiv i sin monomera och ovikta form vid pH 2-3, men visar ingen aktivitet vid eller över pH 4 10. Dessa resultat tyder på att HdeB har sin optimala förkläde aktivitet runt pH 4 10.

t = "Figur 1" src = "/ filer / ftp_upload / 54527 / 54527fig1.jpg" />
Figur 1:. Chaperone aktivitet hos HdeB vid surt pH 0,5 pM MDH inkuberades i förvärmda buffert D vid det indikerade pH i frånvaro eller närvaro av 12,5 pM HdeB för 360 sek vid 43 ° C. PH-värdet för proverna höjdes sedan till pH 7 (såsom anges med asterisk) genom tillsats av från 0,16 till 0,34 volym 2 M obuffrad K 2 HPO 4, var MDH aggregation uppmättes under ytterligare 440 sek genom att övervaka ljusspridning vid 350 nm vid neutralt pH (blå bakgrund). Figur ändras från Dahl et al. 10 .Detta forskning ursprungligen publicerad i Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, lax L, Horowitz S, Bardwell JC, Jakob U. HdeB fungerar som en syraskydds chaperon i bakterier. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright American Society for biokemi och molekylärbiologi.s / ftp_upload / 54527 / 54527fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För att ta itu huruvida HdeB bildar stabila komplex också med andra klient proteiner, var 3 ^ M LDH termiskt ovikta vid 41 ° C i närvaro eller frånvaro av 30 | iM HdeB vid olika pH-betingelser. Analys av sedimenteringsbeteendet hos dessa prover med analytisk ultracentrifugering utfördes vid 22 ° C. När LDH och HdeB inkuberades tillsammans vid pH 7 och 41 ° C, förblev LDH uteslutande tetramer (molekylvikt av 120 kDa) och HdeB förblev dimera. Dessa resultat indikerade att proteinerna inte bildar stabila komplex vid pH 7, och LDH genomgår inte några irreversibla förändringar i oligomerisering upon en 20 min inkubation vid 41 ° C (figur 2, grön linje). På liknande sätt förblev HdeB dimer efter inkubation vid 41 ° C och pH 4,0, vilket indikerar att lågt pH inkubationav HdeB inte påverkar dess oligomerisering tillstånd även under värme chocktillstånd (Figur 2, röd linje). LDH vid inkubation vid pH 4 och 41 ° C i frånvaro av HdeB snabbt samman som indikeras av det faktum att 40% av LDH sedimente innan den första genomsökningen spelades in (Figur 2, som anges i det övre högra hörnet). Den återstående LDH verkade sedimentera främst som monomer (Figur 2, blå linje). I motsats, inkubation av LDH och HdeB vid pH 4 och 41 ° C orsakade en stor del av de två proteinerna till co-sediment (HdeB-LDH C), som bildar en ny art med en molekylvikt av 134 kDa. Denna art utgör sannolikt ett komplex mellan HdeB dimerer och termiskt utspelas LDH. Dessutom i närvaro av HdeB ades ingen signifikant LDH aggregering före sedimentering observerades, vilket överensstämmer med våra in vitro-mätningar aggregering. Dessa resultat visar att HdeB uppvisar förkläde aktivitet i sindimer form vid pH 4,0. Detta står i skarp kontrast till HdeA, vilken är kaperon aktiv i dess monomera form. Den mycket dynamiska karaktär HdeB som gör det möjligt att genomgå strukturella omdisponeringar mellan pH 4 och pH 7 är sannolikt tillräckligt för aktivering av HdeB s chaperonfunktion 10.

figur 2
Figur 2:. Detektion av komplexbildning mellan HdeB och ovikt LDH vid pH 4 med analytisk ultracentrifugering 3 pM LDH inkuberades i närvaro av ett 10-molärt överskott HdeB i buffert D (150 mM KHPO 4, 150 mM NaCl) under 15 min vid 41 ° C vid antingen pH 7 (grön linje) eller pH 4 (svart linje). För jämförelse framställdes LDH enbart (blå linje) eller HdeB enbart (röd linje) inkuberades under 15 min vid 41 ° C vid pH 4. Analytisk ultracentrifugesedimente hastighet användes för att bestämma stökiometrin för HdeB, LDH, och komplexet som bildas mellan HdeB och LDH vid diflunda pH-betingelser. Observera att ~ 40% LDH samman före den första skanningen vid inkubation vid pH 4 och i avsaknad av HdeB (som noterats i det övre högra hörnet). Visas är en sedimenteringskoefficient fördelning tomt (c (s)) analyseras med hjälp av programmet SEDFIT. Bokstäver indikerar respektive oligomera tillstånd av LDH eller HdeB, respektive: HdeB D, HdeB dimer; LDH M, LDH monomer, LDH T, LDH tetramer; HdeB-LDH C, HdeB-LDH-komplexet. Figur ändras från Dahl et al. 10. Denna forskning publicerades ursprungligen i Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, lax L, Horowitz S, Bardwell JC, Jakob U. HdeB fungerar som en syraskydds chaperon i bakterier. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright American Society for biokemi och molekylärbiologi. Klicka här för att se en större versionsionen av denna siffra.

För att testa om HdeB stöder återveckningen av klient proteiner vid neutralisering var HdeB inflytande på återveckningen av pH-denaturerad MDH analyseras. Termiskt denaturerat MDH inkuberades vid olika pH-värden i närvaro eller frånvaro av HdeB. Efter lågt pH inkubation, pH neutraliserades (som initierar MDH återveckning), och MDH-aktiviteten bestämdes efter 2 h. Såsom visas i figur 3, var signifikant reaktivering av MDH uppnås vid neutralisation från pH 4 i närvaro av HdeB. Ingen MDH aktivitet bestämdes när HdeB var frånvarande från det låga pH inkubation.

Figur 3
Figur 3: HdeB underlättar återveckning av syra denatureras MDH till en enzymatiskt aktivt tillstånd 1 pM MDH inkuberades i buffert D vid det indikerade pH under 1 timme vid 37 ° C i frånvaro eller p.resence av 25 pM HdeB. Därefter fick temperaturen skiftas till 20 ° C under 10 min innan proverna neutraliserades till pH 7 genom tillsats av 0,5 M Na 2 HPO 4. Alikvoter togs efter 2 h av inkubation vid 20 ° C och analyserades för MDH-aktivitet. MDH aktivitet vid neutralisering i frånvaro (vita staplar) eller närvaro av HdeB (svarta staplar) visas. Standardavvikelse härledda från åtminstone 3 oberoende mätningar visas. Figur ändras från Dahl et al. 10. Denna forskning publicerades ursprungligen i Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, lax L, Horowitz S, Bardwell JC, Jakob U. HdeB fungerar som en syraskydds chaperon i bakterier. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright American Society for biokemi och molekylärbiologi. Klicka här för att se en större version av dennafigur.

Vår in vitro-data visade att HdeB binder olika modell klient proteiner vid pH 4, förhindrar deras aggregering och underlättar klient omveckning gång neutrala pH-förhållanden har återställts. För att undersöka effekterna av HdeB in vivo, var pH-beroende överlevnadsanalyser utförts med hjälp av temperaturkänsliga rpoH radering stam. Denna stam saknar de flesta chaperoner och är därför mer känsliga för förhöjd temperatur, lågt pH eller oxidativ stress 15. Överuttryck av HdeB under neutrala pH-betingelser visade ingen effekt på tillväxten av stammen, som växte jämförelsevis väl med kontrollstammen som hyser den tomma vektorn pBAD18 (Figur 4, obehandlat). Däremot fann vi tydliga skillnader i sin förmåga att återuppta tillväxt på pH 3 eller pH 4 behandling med HdeB uttrycker stammen visar reproducerbart förbättrad återhämtning från lågt pH treatment än kontrollstammen. I motsats till vår in vitro-data, men förekomst av HdeB hade också en signifikant skyddande effekt vid pH 3. Detta kan bero på den höga koncentrationen av HdeB i cellen, vilket kan förskjuta oligomerisering delstaten HdeB mot dimerer även vid pH 3. Observera att flytta celler till pH 2 eller pH 3 resulterade i mycket snabb och mycket toxiska effekter, medan ingen signifikant dödande observerades när cellerna där odlades vid pH 4 9,10,22.

figur 4
Figur 4: HdeB skyddar E. coli mot surt pH. HdeB (röda cirklar) överuttrycktes i BB7224 (Δ rpoH) i närvaro av 0,5% arabinos vid 30 ° C. BB7224 celler som härbärgerar de tomma vektor pBAD18 användes som kontroll (svarta cirklar). Övre vänstra panelen visar tillväxt av både stregn vid 30 ° C, tillsattes pH 7. Celler skiftat till det angivna pH-värdet genom tillsats av 5 M HCl, och inkuberades under 1 min vid pH 2 (övre högra panelen), 2,5 min vid pH 3 (nedre vänstra panelen) eller 30 min vid pH 4 (nedre högra panelen). Därefter tillsattes kulturerna neutraliserades genom tillsats av lämpliga volymer av 5 M NaOH och tillväxt övervakades i flytande medier vid 30 ° C. Figur ändras från Dahl et al. 10. Denna forskning publicerades ursprungligen i Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, lax L, Horowitz S, Bardwell JC, Jakob U. HdeB fungerar som en syraskydds chaperon i bakterier. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright American Society for biokemi och molekylärbiologi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

För att studera mekanismen för aktivering och chaperonfunktion av HdeB, stora mängder HdeB måste uttryckas och renas. Ett antal expressionsvektorsystem tillgängliga för produktion av höga nivåer av ett målprotein, inklusive pTrc eller pBAD-vektorer, vilka båda används i denna studie. Promotor är lätt åtkomliga för E. coli RNA-polymeras och därmed tillåta starkt uppreglerat uttryck av HdeB i någon E. coli-stam. Denna aspekt är särskilt relevant för in vivo uttryck studie av HdeB under sura stressförhållanden, där rpoH med brist på stammen används. Denna stam saknar de flesta av chaperoner och därmed är mer känsliga för olika faktorer, bland annat förhöjd temperatur, lågt pH och oxidativ stress 15. Som alternativ, studerar överlevnad liknande dem som presenteras här kan utföras i mutantstammar som saknar genen av intresse.

t "> Den experimentella designen för någon chaperon aktivitet eller återveckningsanalys måste övervägas noggrant, både när det gäller den typ av kund, koncentrationen av klient proteinet och buffertbetingelser. I typiska eskorte analyser, modell klient proteiner, såsom citrat syntas, luciferas, eller malatdehydrogenas denatureras i höga koncentrationer av urea eller guanidin-HCl och späddes till denatureringsmedel-buffert för att inducera aggregation 23,13. Mätningar i närvaro av följeslagare avslöjar i vilken utsträckning de hindrar protein aggregation. Alternativt, kunderna är termiskt ovikt och protein aggregation övervakas. i båda fallen är ljusspridande mätningar som avläsning för protein aggregering. aktiva chaperoner förhindra aggregering av utspelas klient proteiner, varigenom en minskning i ljusspridande signalen 6. både av dessa experimentella inställningar kan kombineras med lågt pH inkubation. Förutom att bedöma molecular förkläde aktivitet genom att övervaka deras förmåga att förhindra aggregation av särskilda klient proteiner, kan påverkan av följeslagare på klient återvikning efter återkomsten till icke-påfrestningar testas 24. Detta är särskilt enkelt när klienten proteinerna har enzymatisk aktivitet, som kan användas som kvantitativa avläsning för deras inaktivering och reaktivering. Medan chaperon-medierad återveckning är naturligtvis en ATP-beroende process, har periplasmiska kaperoner såsom HdeA, HdeB och spion visats för att underlätta klienten återveckning i en ATP-oberoende sätt, i överensstämmelse med bristen på energi i periplasman 9,25.

Studera pH-optimum av en syraskydds chaperon såsom HdeB är utmanande på grund av olika orsaker: (i) aggregering beteenden även väletablerade chaperon-klient proteiner såsom citrat syntas skiljer sig vid surt pH; och (ii) endast ett fåtal buffertsystem fungerar i pH-området mellan 2-5 och är suitabell för både kaperonet av intresse och klient proteinet. Vi bestämde oss för att använda fosfatbuffert, även om vi är medvetna om att detta är en icke-ideal buffertsystem under sura pH-betingelser. Emellertid var fosfatbuffert visade sig vara väl lämpad att karakterisera HdeA som syra aktiverad chaperone 9,22. Aggregering mätningar är mycket känsliga mot förändringar i temperatur eller buffertinnehåll. För att eliminera falskt positiva resultat, rekommenderar vi därför att alltid testa påverkan av förkläde minnesbuffert på klient aggregering (Figur 1, buffertkontroll). Ibland aggregering av klient proteinet sker så snabbt att även de bästa förkläde kanske inte kan konkurrera med aggregering processen. Det är därför viktigt att genomföra preliminära tester för att hitta de optimala analysförhållanden. Ett bra exempel på en sådan situation ges i våra ultracentrifugeringsexperiment där inkubation av LDH vid temperaturer> 42 ° C är så snabbt att ävennärvaro av ett överskott av HdeB hindrar inte LDH aggregation. Dessutom har kaperon / sam-chaperon förhållandet eller chaperon / klientförhållande kan bestämmas noggrant 23. Vi började använda en ganska hög HdeB: MDH-förhållande av 50: 1 i preliminära experiment och som hjälpte oss att identifiera pH 4 som den optimala pH för chaperone aktivitet HdeB. Vi fortsatte sedan analysera HdeB: MDH-förhållanden mellan 1: 1 och 50: 1 vid pH 4, identifiera 25: 1 för att vara det mest effektiva förhållandet. Däremot HdeA tryckt MDH aggregering som 10: 1 förkläde: klient förhållanden 6,9,10,22. Därför drar vi slutsatsen att HdeA, i jämförelse med HdeB, är mer effektiva när det gäller att undertrycka MDH aggregering som lägre förkläde: klient förhållandena var tillräcklig för att fullständigt undertrycka MDH aggregering. Ett annat tillvägagångssätt för att undersöka chaperon-medierad suppression av proteinaggregering involverar spin-down-analyser, i vilka klient aggregat avlägsnas genom centrifugering och kvantifierade genom SDS PAGE. Detta tillvägagångssätt lämpar sig också för mPPFÖLJNING påverkan av chaperones på proteinaggregering in vivo. Mutantstammar som antingen överuttrycker eller saknar kaperonet av intresse exponeras för protein utspelas spänningsförhållanden. Därefter lyseras cellerna och lösliga och aggregerade fraktionerna separeras och kvantifieras 15,16,26.

För detektion av klient chaperone komplex, tillämpade vi analytisk ultracentrifugering. Det skall här noteras att baserat på försöksuppställningen är det inte möjligt att direkt kvantifiera mängden HdeB och LDH monomerer bundna i detta komplex, eftersom båda proteinerna absorberar vid 280 nm. Om så önskas, kan stökiometrin för kaperonet-client-komplexet bestämmas genom att separat märkning chaperon och klient protein med en kromofor, vars excitation maximum ligger inom det synliga området. Alternativt kan stökiometrin för klienter att chaperones inom komplexen bestämmas genom att använda naturlig PAGE i kombination med kvantitativ western blöt. Genom att följa de protokoll som presenteras här, kunde vi karaktärisera två molekylära chaperoner, HdeA och HdeB 9,10,22. I allmänhet kan dessa analyser även användas för att undersöka rollen av potentiella inhibitorer av molekylära chaperoner i proteinåterveckning in vitro och in vivo eller kan tillämpas för att testa syntetiska chaperones för deras förmåga att förhindra klient aggregation under sura stress. Dessutom kan de protokoll som presenteras här kan användas för analys av punktmutationer och / eller stympade varianter av syraaktiverade chaperoner i syfte att belysa i mekanismen för deras aktivering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi tackar Dr Claudia Cremers för hennes användbara råd om eskortering analyser. Ken Wan är känd för sin tekniskt stöd i HdeB rening. Detta arbete stöddes av Howard Hughes Medical Institute (till JCAB) och National Institutes of Health bidrag RO1 GM102829 till JCAB och UJJ-UD stöds av en postdoktoral forskning stipendium från den tyska Research Foundation (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NEB10-beta E. coli cells New England Biolabs C3019I
Ampicillin Gold Biotechnology A-301-3
LB Broth mix, Lennox LAB Express 3003
IPTG Gold Biotechnology I2481C50
Sodium chloride Fisher Scientific S271-10
Tris Amresco 0826-5kg
EDTA Fisher Scientific BP120-500
Polymyxin B sulfate  ICN Biomedicals Inc. 100565
0.2 µm pore sterile Syringe Filter Corning 431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml) GE Healthcare Life Sciences 17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15% Bio-Rad 4561046
Malate dehydrogenase (MDH) Roche 10127914001
Potassium phosphate (Monobasic) Fisher Scientific BP362-500
Potassium phosphate (Dibasic) Fisher Scientific BP363-1
F-4500 fluorescence spectrophotometer Hitachi FL25
Oxaloacetate Sigma O4126-5G
NADH Sigma  N8129-100MG
Sodium phosphate monobasic Sigma  S9390-2.5KG
Sodium phosphate dibasic Sigma  S397-500
Lactate dehydrogenase (LDH) Roche 10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge Beckman Coulter 392764
Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled Beckman Coulter 306493
AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place Beckman Coulter 363782
Wizard Plus Miniprep Kit Promega A1470 used for plasmid purification (Protocol 5.1)
L-arabinose Gold Biotechnology A-300-500
Glycine DOT Scientific Inc DSG36050-1000
Fluorescence Cell cuvette Hellma Analytics 119004F-10-40
Oligonucleotides Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0530S
dNTP set Invitrogen 10297018
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-212
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL Millipore UFC900324
Centrifuge Avanti J-26XPI Beckman Coulter 393127
Varian Cary 50 spectrophotometer Agilent Tech
Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa Spectrum Laboratories 132650
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K Millipore UFC803024
SDS Fisher Scientific bp166-500
Veriti 96-Well Thermal Cycler Thermo Fisher 4375786

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, J. L. The Role of Gastric Acid in Preventing Foodborne Disease and How Bacteria Overcome Acid Conditions. J Food Protect. 66, 1292-1303 (2003).
  2. Hong, W., Wu, Y. E., Fu, X., Chang, Z. Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in enteric bacteria. Trends Microbiol. 20 (7), 328-335 (2012).
  3. Koebnik, R., Locher, K. P., Van Gelder, P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
  4. Reichmann, D., Xu, Y., et al. Order out of Disorder: Working Cycle of an Intrinsically Unfolded Chaperone. Cell. 148 (5), 947-957 (2012).
  5. Bardwell, J. C. A., Jakob, U. Conditional disorder in chaperone action. Trends Biochem Sci. 37 (12), 517-525 (2012).
  6. Tapley, T. L., Korner, J. L., et al. Structural plasticity of an acid-activated chaperone allows promiscuous substrate binding. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5557-5562 (2009).
  7. Hong, W., Jiao, W., et al. Periplasmic Protein HdeA Exhibits Chaperone-like Activity Exclusively within Stomach pH Range by Transforming into Disordered Conformation. J Biol Chem. 280 (29), 27029-27034 (2005).
  8. Zhang, B. W., Brunetti, L., Brooks, C. L. III Probing pH-Dependent Dissociation of HdeA Dimers. J Am Chem Soc. 133, 19393-19398 (2011).
  9. Tapley, T. L., Franzmann, T. M., Chakraborty, S., Jakob, U., Bardwell, J. C. A. Protein refolding by pH-triggered chaperone binding and release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 1071-1076 (2010).
  10. Dahl, J. -U., Koldewey, P., Salmon, L., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. HdeB Functions as an Acid-protective Chaperone in Bacteria. J Biol Chem. 290 (1), 65-75 (2015).
  11. Waterman, S. R., Small, P. L. C. Identification of sigmas-dependent genes associated with the stationary-phase acid-resistance phenotype of Shigella flexneri. Mol Microbiol. 21 (5), 925-940 (1996).
  12. Mucacic, M., Baneyx, F. Chaperone Hsp31 Contributes to Acid Resistance in Stationary-Phase Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 73 (3), 1014-1018 (2007).
  13. Daugherty, D. L., Rozema, D., Hanson, P. E., Gellman, S. H. Artificial Chaperone-assisted Refolding of Citrate Synthase. J Biol Chem. 273, 33961-33971 (1998).
  14. Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. A. Chaperone Activity with a Redox Switch. Cell. 96 (3), 341-352 (1999).
  15. Guisbert, E., Yura, T., Rhodius, V. A., Gross, C. A. Convergence of Molecular, Modeling, and Systems Approaches for an Understanding of the Escherichia coli Heat Shock Response. Microbiol Mol Biol Rev. 72 (3), 545-554 (2008).
  16. Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Mol Microbiol. 40 (2), 397-413 (2001).
  17. Schuck, P. Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling. Biophys J. 78 (3), 1606-1619 (2000).
  18. Analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit. analyticalultracentrifugation.com. , Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm (2016).
  19. Sednterp. bitcwiki.sr.unh.edu. , Available from: http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page (2012).
  20. Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution. Methods. 95, 55-61 (2016).
  21. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harb Protoc. 2006, (2006).
  22. Foit, L., George, J. S., Zhang, B. inW., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. Chaperone activation by unfolding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1254-1262 (2013).
  23. Nicoll, W. S., Boshoff, A., Ludewig, M. H., Hennessy, F., Jung, M., Blatch, G. L. Approaches to the isolation and characterization of molecular chaperones. Protein Express Purif. 46, 1-15 (2006).
  24. Minami, Y., Hohfeld, J., Ohtsuka, K., Hartl, F. U. Regulation of the Heat-shock Protein 70 Reaction Cycle by the Mammalian DnaJ Homolog, Hsp40. J Biol Chem. 271 (32), 19617-19624 (1996).
  25. Quan, S., Koldewey, P. Genetic selection designed to stabilize proteins uncovers a chaperone called Spy. Nat Struct Mol Biol. 18, 262-269 (2011).
  26. Gray, M. J., Wholey, W. Y. Polyphosphate Is a Primordial Chaperone. Mol Cell. 53 (5), 689-699 (2014).

Tags

Biokemi Molecular förkläde Acid Stress stress Protein Aggregation Protein Fälla bakterier Light Scattering Protein Återveck protein-proteininteraktion Protein kvalitetskontroll.
Detektering av den pH-beroende aktivitet för<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; och<em&gt; In Vivo</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dahl, J. U., Koldewey, P., Bardwell, … More

Dahl, J. U., Koldewey, P., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (116), e54527, doi:10.3791/54527 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter