Summary
Denne undersøgelse beskriver biofysiske, biokemiske og molekylære teknikker til at karakterisere chaperonaktivitet af Escherichia coli HdeB under sure pH-betingelser. Disse metoder er blevet anvendt med succes til andre syre-beskyttende chaperoner såsom HdeA og kan ændres til at arbejde for andre chaperoner og stresstilstande.
Abstract
Bakterier ofte udsat for miljømæssige ændringer, såsom ændringer i pH, temperatur, redox status, lys eksponering eller mekanisk kraft. Mange af disse betingelser give protein udfolder sig i cellen og har skadelig indvirkning på overlevelsen af organismen. En gruppe af ubeslægtede, stress-specifikke molekylære chaperoner er blevet vist at spille en væsentlig rolle i overlevelsen af disse stressbetingelser. Mens fuldt foldet og chaperone-inaktiv, før stress, disse proteiner hurtigt udfolde og blive chaperone-aktive under specifikke stress betingelser. Når den er aktiveret, disse konditionelt uordnede chaperoner binde til et stort antal forskellige aggregering-tilbøjelige proteiner, forhindre deres aggregering og enten direkte eller indirekte fremmer protein refoldning ved tilbagevenden til ikke-stressbetingelser. Den primære metode til at få en mere detaljeret forståelse om mekanismen for deres aktivering og klient anerkendelse indebærer rensning og subsequent karakterisering af disse proteiner under anvendelse af in vitro chaperone assays. Opfølgning in vivo stress analyser er helt afgørende for selvstændigt bekræfte opnåede in vitro resultater.
Denne protokol beskriver in vitro og in vivo-metoder til at karakterisere chaperonaktivitet af E. coli HdeB, en syre-aktiveret chaperone. Lysspredningsmålinger blev anvendt som en bekvem udlæsning for HdeB kapacitet til at forebygge syre-induceret aggregering af en etableret model klient protein, MDH, in vitro. Analytiske ultracentrifugering eksperimenter blev anvendt til at afsløre kompleksdannelse mellem HdeB og dets klient protein LDH, at kaste lys ind i skæbne klient proteiner når de vender tilbage til ikke-stress betingelser. Enzymatisk aktivitet assays af klienten proteiner blev udført for at overvåge virkningerne af HdeB på pH-induceret klient inaktivering og genaktivering. Endelig blev overlevelsesstudier anvendes til monitor indflydelse af HdeB s chaperone funktion in vivo.
Introduction
En fælles naturlige miljø, hvor mikrobielle patogener oplever syre-induceret proteinudfoldning betingelser er den mammale maven (pH område 1-4), hvis sur pH tjener som en effektiv barriere mod fødevarebårne patogener 1. Proteinudfoldning og aggregering, som er forårsaget af aminosyresidekæde protonering, påvirker biologiske processer, skader cellulære strukturer og i sidste ende forårsager celledød 1,2. Da pH af den bakterielle periplasma ligevægt næsten øjeblikkeligt med den miljømæssige pH på grund af den frie diffusion af protoner gennem den porøse ydre membran, periplasmatiske og indre membranproteiner fra gramnegative bakterier er de mest sårbare cellulære komponenter under syre-stressbetingelser 3. For at beskytte deres periplasmatisk proteom mod hurtig syre-medieret skade, Gram-negative bakterier udnytte syre-aktiverede periplasmatiske chaperoner HdeA og HdeB. HdeA er en betinget uorganiseret chaperone
Protokollerne præsenteres her tillader at overvåge pH-afhængig chaperonaktivitet af HdeB in vitro og in vivo 10 og kan anvendes til at undersøge andre chaperonersåsom Hsp31. Alternativt kan det komplekse net af transkriptionsfaktorer, der styrer ekspressionen af hdeAB potentielt undersøges af in vivo-stress assay. At karakterisere chaperone funktionen af proteiner in vivo, kan forskellige forsøgsopstillinger anvendes. En rute er at anvende protein udfoldning stresstilstande og fænotypisk karakterisering mutantstammer, der enten overudtrykker genet af interesse eller bærer en deletion af genet. Proteom undersøgelser kan udføres for at identificere, hvilke proteiner ikke længere aggregat under stressbetingelser når chaperonen er til stede, eller påvirkning af en chaperone på et specifikt enzym kan bestemmes under stressbetingelser anvendelse af enzymatiske assays 14-16. I denne undersøgelse valgte vi at overudtrykke HdeB i en rpoH deletion-stamme, som mangler varmechok sigma faktoren 32. RpoH styrer ekspressionen af alle større E. coli chaperones og sletning er kendt for at øge sensitivity for miljømæssige stress betingelser, der forårsager protein udfoldning 15. In vivo chaperonaktivitet af HdeB blev bestemt ved at overvåge dets evne til at undertrykke pH følsomheden af Δ rpoH-stamme. Alt i alt, de protokoller, der præsenteres her giver en hurtig og enkel fremgangsmåde til at karakterisere aktiviteten af et syreaktiveret chaperone in vitro såvel som in vivo sammenhæng.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ekspression og oprensning af Periplasmisk HdeB
BEMÆRK: HdeB blev udtrykt i E. coli-celler, der huser plasmidet pTrc- hdeB 10, og oprenset fra periplasmaet ved polymyxin lysis.
- Forbered en overnatning kultur af E. coli-celler, der huser plasmidet pTrc- hdeB 10 i 30 ml LB indeholdende 200 pg / ml ampicillin (LB Amp). Inokulere fire 1 L kulturer af LB Amp og dyrke dem ved 37 ° C og 200 rpm, indtil OD 600 nm på 0,7 er nået. Derefter tilsættes 300 pM IPTG for at inducere ekspressionen af HdeB og formindske væksten temperaturen til 30 ° C.
- Efter 5 timer af proteinekspression ved 30 ° C, Cellerne høstes ved centrifugering ved 8000 x g i 5 min ved 4 ° C.
- Vask cellepelleten med 100 ml buffer A (50 mM Tris / HCl, 50 mM NaCl, pH 7,5) og centrifugeres cellerne igen ved 8.000 x g i 5 min ved 4 ° C.
- Efterfølgende resuspendercellepelleten i 80 ml buffer A, indeholdende 1 mg / ml polymyxin sulfat. Til effektiv forstyrrelse af den ydre membran, forsigtigt omrøres suspensionen i 1 time ved 4 ° C.
- At fjerne den cytoplasmatiske fraktion og cellerester, centrifugeres suspensionen i 20 minutter ved 15.000 xg ved 4 ° C. Dette resulterer i ~ 60 ml supernatant indeholdende det opløselige HdeB.
- Dialysere supernatanten indeholdende det periplasmatiske ekstrakt natten over mod 150x volumen buffer B (20 mM Tris / HCI, 0,5 mM EDTA, pH 8,0) ved anvendelse af en dialysemembran med 6 kDa MW afskæring. Koncentrer proteinerne til 15 ml ved anvendelse af centrifugal filteranlæg med en molekylvægt afskæring af 3 kDa. Filtrer proteinopløsningen ved anvendelse af en 0,2 um porefilter.
- Påfør proteinet på en anionbytterchromatografi søjle (søjlevolumen 5 ml), der er blevet ækvilibreret med 5 søjlevolumener puffer B med en strømningshastighed på 2,5 ml / min. Når proteinet er påsat søjlen, vaskes søjlen med puffer B i 10 min veden strømningshastighed på 2,5 ml / min. Eluer HdeB med en lineær gradient fra 0 til 0,5 M NaCl i buffer B over et tidsrum på 50 min med en strømningshastighed på 2,5 ml / min 6.
- Identificere fraktioner indeholdende HdeB under anvendelse af en 15% SDS-PAGE. Bland 20 gl prøve med 5 pi 5x reduceret SDS loading buffer. Load 10 pi på gelen og køre i Tris-glycinbuffer (14,4 g / L glycin, 2,9 g / l Tris, 1 g / l natriumdodecylsulfat, pH 8,3). Kør gelen ved 150 V, indtil bromphenol-båndet er vandret tæt på bunden af gelen (~ 45 min).
- Pool alle HdeB fraktioner dialyseres ved 4 ° C natten over mod 4 liter HdeB opbevaringsbuffer (50 mM Tris / HCl, 200 mM NaCl, pH 8,0), og opkoncentrer proteinet til ca. 300 pM ved anvendelse af centrifugal filteranlæg med en molekylvægt afskæring af 3 kDa. Bestemme koncentrationen af HdeB ved 280 nm ved ekstinktionskoefficienten ε 280nm = 15.595 M-1 cm-1. Fremstilling af 100 pi alikvoter og flash-frize aliquoterne i flydende nitrogen.
BEMÆRK: HdeB kan opbevares ved -70 ° C i mindst 6 måneder.
2. Chaperone Activity Assay Brug Termisk Unfolding malatdehydrogenase (MDH)
BEMÆRK: Indflydelsen af oprenset HdeB om sammenlægning af termisk udfoldning porcin mitokondriel malat-dehydrogenase (MDH) ved forskellige pH-værdier blev overvåget som beskrevet nedenfor. Alle de anførte proteinkoncentrationer henvise til monomerkoncentration.
- Til fremstilling MDH, dialyse MDH ved 4 ° C natten over mod 4 liter puffer C (50 mM kaliumphosphat, 50 mM NaCl, pH 7,5) og koncentreres proteinet til ca. 100 pM ved anvendelse af centrifugal filteranlæg med en molekylvægt cut-off på 30 kDa.
BEMÆRK: Omhyggelig dialyse af MDH er påkrævet som MDH leveres som ammoniumsulfat løsning. - At fjerne aggregater, centrifugeres proteinet i 20 minutter ved 20.000 xg ved 4 ° C. Bestem MDH koncentration ved absorbans ved 280 nm (ε <sub> 280 nm = 7.950 M-1 cm-1). Forbered 50 pi prøver af MDH og flash-fryse portioner til opbevaring.
- Anbring 1 ml kvartscuvette i et fluorescens-spektrofotometer udstyret med temperaturstyret prøveholdere og omrører. Sæt λ ex / em til 350 nm.
- Tilføj passende mængder af forvarmet (43 ° C) buffer D (150 mM kaliumphosphat, 150 mM NaCl) ved de ønskede pH-værdier (her: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0, og pH 5,0) til cuvetten og sæt temperaturen i kuvetteholderen til 43 ° C. Det samlede volumen er 1.000 pi.
- Tilføj 12,5 uM HdeB (eller alternativt det samme volumen HdeB storage buffer for bufferen kontrol) til bufferen, efterfulgt af tilsætning af 0,5 uM MDH. Begynd overvågning lysspredning. Inkubér reaktionen for 360 sek at give tilstrækkelig udfoldelse af MDH.
- Hæve pH-værdien til 7 ved tilsætning af 0,16 til 0,34 volumen 2 M upufret K 2 HPO 4 og fortsætte recording lysspredning for en anden 440 sek.
- Indstil omfanget af MDH aggregering, der optages i fravær af chaperonen ved en defineret tidspunkt efter neutralisation (her efter 500 sek, hvis maksimal lysspredning af MDH blev observeret) til 100%. Normalisere HdeB aktivitet til lysspredning signal af MDH i fravær af HdeB ved hver angivet pH-værdi.
3. Påvisning af HdeB-LDH Complex Stiftelse ved Analytisk Ultracentifugering (AUC)
BEMÆRK: sedimentationshastigheden eksperimenter af HdeB alene eller i kompleks med termisk udfoldning lactatdehydrogenase (LDH) blev udført under anvendelse af en analytisk ultracentrifuge.
- Til fremstilling LDH, dialyse LDH ved 4 ° C natten over mod 4 liter puffer C (50 mM kaliumphosphat, 50 mM NaCl, pH 7,5) og koncentreres proteinet til ca. 200 pM ved anvendelse af centrifugal filteranlæg med en molekylvægt cut-off på 30 kDa.
BEMÆRK: Omhyggelig dialyse af LDH er påkrævet som LDH leveres som ammoniumsulfatopløsning. - At fjerne aggregater, centrifuge LDH i 20 minutter ved 20.000 xg ved 4 ° C. Bestem LDH koncentration ved absorbans ved 280 nm (ε 280 nm = 43.680 M-1 cm-1). Forbered 50 pi prøver af LDH og flash-fryse portioner til opbevaring.
- Inkuber 3 pM LDH i nærværelse og fravær af 30 uM HdeB i buffer D (pH 4 og 7, henholdsvis) i 15 min ved 41 ° C.
BEMÆRK: Inkubation af LDH ved højere temperaturer resulterer i sin fuldstændige aggregering, og ingen chaperone virkning HdeB kan observeres. - Lad prøverne køle ned til stuetemperatur. Derefter load prøver i celler, der indeholder standard sektor formet 2-kanals centerpieces med 1,2 cm lysvej. Indlæse celler i ultracentrifuge og tempereres til 22 ° C i mindst 1 time før sedimentering.
- Spin prøver ved 22 ° C og 167.000 xg i den respektive rotor for 12 timer, og overvåge sedimentation af proteinet kontinuerligt ved 280 nm. Som tidligere demonstreret, er signal-støj-forholdet forbedres, når den transmitterede lysintensitet for hver kanal måles snarere end absorbans. Dette forbedrer også kvaliteten af den efterfølgende data montering.
- Gennemføre dataanalyse med SEDFIT (version 15.01b, December 2015), ved hjælp af den kontinuerlige c (e) distributionsmodel 17. En tutorial der beskriver hvordan man bruger SEDFIT kan findes i henvisning 18.
- Indstil konfidensniveau for ME (Maximum Entropy) legalisering til 0,7.
- Beregn buffer densitet samt viskositeten ved hjælp SEDNTERP 19. For at estimere mængden af aggregeret klient protein, sammenligne integralerne af sedimenteret LDH i pH 4 til pH 7 som reference.
BEMÆRK: Integration af de sedimentation distributions- plots kan gøres direkte i SEDFIT. Alternativ software til at analysere sedimentationshastigheden data findes i en nylig 20. </ Li>
4. Overvågning MDH Inaktivering og Reaktivering i overværelse af HdeB
BEMÆRK: Indflydelsen af oprenset HdeB på genfoldning af pH-udfoldede MDH blev bestemt ved overvågning MDH aktivitet efter neutralisering.
- Inkuber 1 pM MDH i buffer D ved de ønskede pH-værdier (her: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0, og pH 5,0) i 1 time ved 37 ° C i fravær eller nærvær af 25 uM HdeB. Derefter skifter temperaturen til 20 ° C i 10 minutter.
BEMÆRK: Ingen MDH genfoldning blev observeret selv i nærværelse af HdeB når MDH blev inkuberet ved temperaturer på over 37 ° C. - For at påbegynde refoldning af syre denatureret MDH, neutralisere prøverne til pH 7 ved tilsætning af 0,13 til 0,42 volumen 0,5 M natriumphosphat, pH 8,0.
- Efter inkubering i 2 timer ved 20 ° C, fastlægge MDH aktivitet ved at overvåge faldet af NADH ved 340 nm 9.
BEMÆRK: MDH katalyserer NADH-afhængig reduktion af oxalacetat til L-malat.
BEMÆRK: Slutkoncentrationen af MDH i assaypufferen bør være 44 nM. - Overvåg ændringen i absorbans anvendelse af et spektrofotometer, der er udstyret med en Peltier temperaturkontrol blok indstillet til 20 ° C.
- Reporter MDH aktivitet i forhold til 44 nM nativt MDH, der er blevet holdt ved pH 7,0.
5. Virkning af HdeB Overekspression på E. coli Overlevelse under Acid Stress
BEMÆRK: E. coli MG1655 genomisk DNA blev isoleret ved anvendelse af en offentliggjort protokol 21.
- Forstærk hdeB fra E. coli MG1655 ved PCR ved anvendelse af primere hdeB - BamH I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATT og hdeB - EcoR I-fw GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C.
- Opsæt PCR-reaktionen i 50 pi som følger: 10 pi 5x polymerase buffer, 200 uM dNTP'er, 0,5 pM primer JUD2, 0,5 pM primer JUD5, 150 ng genomisk DNA MG1655, 0,5 pi DNA-polymerase, tilføje Hedeselskabet 2 O til 50 pi.
- Udfør amplifikation af hdeB som følger: Trin 1: 5 min ved 95 ° C, 1 cycle; trin 2: 30 sekunder ved 95 ° C, 30 sekunder ved 55 ° C, 30 sekunder ved 72 ° C, 40 cyklusser; Trin 3: 10 min ved 72 ° C.
- Klon resulterende PCR-fragment ind i EcoR I og BamH I-stederne i plasmid pBAD18 anvendelse af standardmetoder til restriktionssted kloning. Oprens plasmidet under anvendelse af et plasmid oprensningskit ifølge producentens instruktioner. Kontroller det resulterende plasmid ved sekventering 10.
- Omdan plasmidet udtrykker HdeB eller de tomme vektor kontrol pBAD18 i stammen BB7224 (Δ RpoH) (genotype: F -, λ -, E14 -, [araD139] B / R [6; (argF-lac) 169 flhD5301 Δ (fruK-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm R) rbsR22 Δ (FIMB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 ZHF :: Tn 10 (Tc S) suhX401 deoC1 araD + rpoH :: can +; 16) under anvendelse af kemisk kompetente celler.
BEMÆRK: Denne stamme er temperaturfølsomt. - Efter 45 sek varmechok ved 42 ° C og før udpladning inkuberes cellerne ved 30 ° C og 200 rpm. Udfør enkelt koloni streak-outs af de positive kloner og inkuberes natten over ved 30 ° C. Forbered en overnatning kultur i 50 ml LB Amp og dyrke cellerne ved 200 rpm og 30 ° C.
- Fortynd overnatskulturer 40 gange i 25 ml LB Amp og vokse bakterierne i nærværelse af 0,5% arabinose (Ara) ved 30 ° C og 200 rpm til en OD 600 nm = 1,0 at inducere HdeB proteinekspression.
- For pH skift eksperimenter bruge LBAmp + Ara at fortynde cellerne til OD 600 nm på 0,5 og tilpasse sig til de respektive pH-værdier (her: pH 2,0, pH 3,0 og pH 4,0) ved tilsætning af passende mængder af 5 M HCI.
- Efter de angivne tidspunkter (pH 2, 1 min; pH 3, 2,5 min; pH 4, 30 min), neutralisere kulturerne ved tilsætning af passende mængder af 5 M NaOH.
- Overvåge udviklingen af de neutraliserede kulturer i flydende kultur i 12 timer ved 30 ° C under anvendelse af OD-målinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HdeA og HdeB er homologe E. coli proteiner, kendt for at beskytte periplasmatiske proteiner mod syre stresstilstande 10. Vores arbejde viste, at ligner HdeA, HdeB fungerer også som en syre aktiveret molekylær chaperone. Men i modsætning til HdeA, HdeB funktioner ved et pH, der stadig potentielt bakteriedræbende, men signifikant højere end pH-optimum på HdeA 6,9,10,22. For at undersøge pH-optimum på HdeB s chaperone-aktivitet in vitro, blev nativ MDH fortyndet i foropvarmet (43 ° C) buffer med den angivne pH-værdi i nærvær eller fravær af HdeB. Efter 360 sek inkubation blev inkubationen reaktionen neutraliseres. Denne neutralisering udløser sammenlægning af MDH ved 43 ° C 9. Repræsentative resultater viser, at den lysspredende signal af MDH i fravær af HdeB øger dramatisk ved neutralisering grund aggregering af MDH (figur 1, BLack linje ved hver pH). I nærvær af HdeB, er det lysspredende signal faldt betydeligt ved neutralisering fra pH 4 eller pH 5 indikerer, at HdeB forhindrer aggregering af MDH (figur 1, pH 4 og pH 5). I modsætning hertil, ved neutralisering af pH 2 og pH 3, MDH aggregater hurtigt i samme omfang uafhængigt af tilstedeværelsen eller fraværet af HdeB (figur 1, pH 2 og pH 3), hvilket indikerer, at pH-optimum for HdeB s chaperonaktivitet er mellem pH 4 og 5. HdeB opbevaringsbuffer havde ingen virkning på MDH aggregering (figur 1, puffer kontrol), hvilket indikerer, at den reducerede lysspredende signal af MDH i nærvær af HdeB ved pH 4 er på grund af sin chaperone-funktion. HdeA er chaperone aktiv i sin monomere og udfoldede form ved pH 2-3, men viser ingen aktivitet ved eller over pH 4 10. Disse resultater antyder, HdeB har sin optimale chaperonaktivitet omkring pH 4 10.
t = "Figur 1" src = "/ files / ftp_upload / 54.527 / 54527fig1.jpg" />
Figur 1:. Chaperonaktivitet af HdeB ved sur pH 0,5 uM MDH blev inkuberet i forvarmet buffer D ved den angivne pH-værdi i fravær eller nærvær af 12,5 pM HdeB til 360 sekunder ved 43 ° C. PH af prøverne blev derefter hævet til pH 7 (som angivet med stjernen) ved tilsætning af 0,16 til 0,34 volumen 2 M upufret K 2 HPO 4 blev MDH aggregering målt i yderligere 440 sekunder ved at overvåge lysspredning ved 350 nm ved neutral pH (blå baggrund). Figur er modificeret fra Dahl et al. 10. .Dette forskning blev oprindeligt offentliggjort i Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, Salmon L, Horowitz S, Bardwell JC, Jakob U. HdeB fungerer som en syre-beskyttende chaperone i bakterier. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright American Society for Biokemi og Molekylær Biologi.s / ftp_upload / 54.527 / 54527fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
For at løse hvorvidt HdeB danner stabile komplekser også med andre klient-proteiner, blev 3 pM LDH termisk udfoldet ved 41 ° C i nærvær eller fravær af 30 uM HdeB ved forskellige pH-betingelser. Analyse af sedimentation opførsel af disse prøver ved analytisk ultracentrifugering blev udført ved 22 ° C. Når LDH og HdeB blev inkuberet sammen ved pH 7 og 41 ° C, LDH forblev udelukkende tetramer (molekylvægt på 120 kDa) og HdeB forblev dimer. Disse resultater viste, at proteinerne ikke danner stabile komplekser ved pH 7, og LDH ikke undergår irreversible ændringer i oligomerisering upon en 20 minutters inkubation ved 41 ° C (figur 2, grøn linje). Tilsvarende HdeB forblev dimer efter inkubation ved 41 ° C og pH 4,0, hvilket indikerer, at lav pH inkubationaf HdeB ikke påvirker dets oligomerisering tilstand, selv under varme chok betingelser (figur 2, rød linje). LDH, når de inkuberes ved pH 4 og 41 ° C i fravær af HdeB hurtigt sammen som angivet ved den kendsgerning, at 40% af LDH sedimenteret før den første scanning blev registreret (figur 2, er angivet i det øverste højre hjørne). Den resterende LDH syntes at sedimentere overvejende som monomer (figur 2, blå linie). I modsætning hertil inkubation af LDH og HdeB ved pH 4 og 41 ° C forårsagede en stor del af de to proteiner til at co-sediment (HdeB-LDH C), danner en ny art med en molekylvægt på 134 kDa. Denne art sandsynligvis repræsenterer en kompleks mellem HdeB dimerer og termisk udfolder LDH. Endvidere i nærvær af HdeB blev ingen signifikant LDH aggregering før sedimentering observeret, hvilket er i overensstemmelse med vores in vitro aggregation målinger. Disse resultater viser, HdeB udviser chaperonaktivitet i sindimere form ved pH 4,0. Dette er i skarp kontrast til HdeA, som chaperone aktiv i sin monomere form. Den meget dynamiske karakter HdeB der gør det muligt at gennemgå strukturelle omlejringer mellem pH 4 og pH 7 er sandsynligt tilstrækkelig til aktivering af HdeB s chaperone-funktion 10.
Figur 2:. Påvisning af kompleksdannelse mellem HdeB og udfoldede LDH ved pH 4 ved analytisk ultracentrifugering 3 uM LDH blev inkuberet i nærvær af en 10-molært overskud HdeB i buffer D (150 mM KHPO 4, 150 mM NaCl) i 15 minutter ved 41 ° C ved enten pH 7 (grøn linje) eller pH 4 (sort linie). Til sammenligning blev LDH alene (blå linie) eller HdeB alene (rød linje) inkuberet i 15 minutter ved 41 ° C ved pH 4. Analytisk ultracentrifugering sedimentationshastigheden blev anvendt til at bestemme støkiometrien af HdeB, LDH, og det dannede kompleks mellem HdeB og LDH ved difskellige pH-betingelser. Bemærk, at ~ 40% LDH aggregeret forud for den første scanning, når de inkuberes ved pH 4 og i fravær af HdeB (som nævnt i øverste højre hjørne). Vist er en sedimentationskoefficient fordeling plot (c (r)) analyseret under anvendelse af programmet SEDFIT. Breve angiver den respektive oligomere tilstand af LDH eller HdeB henholdsvis: HdeB D, HdeB dimer; LDH M, LDH monomer, LDH T, LDH tetramer; HdeB-LDH C, HdeB-LDH-kompleks. Figuren er modificeret fra Dahl et al. 10. Denne forskning blev oprindeligt offentliggjort i Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, Salmon L, Horowitz S, Bardwell JC, Jakob U. HdeB fungerer som en syre-beskyttende chaperone i bakterier. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright American Society for Biokemi og Molekylær Biologi. Klik her for at se et større version af dette tal.
For at teste, om HdeB støtter refoldning af kundens proteiner upon neutralisering blev HdeB indflydelse på genfoldning af pH-denatureret MDH analyseret. Termisk denatureret MDH blev inkuberet ved forskellige pH-værdier i nærvær eller fravær af HdeB. Efter lav pH inkubering blev pH neutraliseret (som initierer MDH refoldning), og blev bestemt MDH aktivitet efter 2 timer. Som vist i figur 3, blev signifikant reaktivering af MDH opnået ved neutralisation fra pH 4 i nærvær af HdeB. Ingen MDH aktivitet blev bestemt, da HdeB var fraværende fra den lave pH inkubation.
Figur 3: HdeB letter refoldning af syre denatureret MDH til en enzymatisk aktiv tilstand 1 uM MDH blev inkuberet i buffer D ved den angivne pH i 1 time ved 37 ° C i fravær eller s.resence af 25 uM HdeB. Derefter blev temperaturen ændret til 20 ° C i 10 minutter, før prøverne blev neutraliseret til pH 7 ved tilsætning af 0,5 M Na 2 HPO 4. Alikvoter blev udtaget efter 2 timer af inkubation ved 20 ° C og undersøgt for MDH aktivitet. MDH aktivitet ved neutralisering i fravær (hvide søjler) eller tilstedeværelse af HdeB (sorte søjler) er vist. Standardafvigelse afledt af mindst 3 uafhængige målinger er vist. Figuren er modificeret fra Dahl et al. 10. Denne forskning blev oprindeligt offentliggjort i Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, Salmon L, Horowitz S, Bardwell JC, Jakob U. HdeB fungerer som en syre-beskyttende chaperone i bakterier. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright American Society for Biokemi og Molekylær Biologi. Klik her for at se en større version af dennefigur.
Vores in vitro-data viste, at HdeB binder forskellige model klient proteiner ved pH 4, forhindrer deres sammenlægning og letter klient genfoldning engang neutrale pH-betingelser er genoprettet. At undersøge virkningerne af HdeB in vivo, blev pH-afhængige overlevelse assays udført under anvendelse af temperaturfølsomme rpoH deletion-stamme. Denne stamme mangler fleste chaperoner og er derfor mere modtagelige for forhøjet temperatur, lavt pH eller oxidativt stress 15. Overekspression af HdeB under neutrale pH-betingelser viste ingen effekt på vækstraten af stammen, som voksede sammenligneligt godt til kontrol stamme, der huser den tomme vektor pBAD18 (figur 4, ubehandlet). I modsætning hertil fandt vi klare forskelle i deres evne til at genoptage vækst på pH 3 eller pH 4 behandling med HdeB overekspression stammen viser reproducerbart forbedret inddrivelse fra lav pH skatment end kontrolstammen. I modsætning til vores in vitro-data, men tilstedeværelse af HdeB havde også en signifikant beskyttende virkning ved pH 3. Dette kan skyldes, at den høje koncentration af HdeB i cellen, hvilket kan forskyde oligomerisering tilstand af HdeB dybt dimerer, selv ved pH 3. Bemærk, at flytte celler til pH 2 eller pH 3 resulterede i meget hurtige og meget toksiske virkninger, medens der ikke blev observeret nogen signifikant drab når celler når inkuberet ved pH 4 9,10,22.
Figur 4: HdeB beskytter E. coli mod sur pH. HdeB (røde cirkler) blev overudtrykt i BB7224 (Δ rpoH) i nærvær af 0,5% arabinose ved 30 ° C. BB7224 celler indeholdende de tomme vektor pBAD18 blev anvendt som kontrol (sorte cirkler). Øverste venstre panel viser vækst i både stregnskyl ved 30 ° C blev pH 7. Celler flyttet til den angivne pH ved tilsætning af 5 M HCI og inkuberet i 1 minut ved pH 2 (øvre højre panel), 2,5 min ved pH 3 (nederste venstre panel) eller 30 minutter ved pH 4 (nederst til højre panel). Efterfølgende blev kulturer neutraliseret ved tilsætning af passende mængder af 5 M NaOH, og væksten blev overvåget i flydende medier ved 30 ° C. Figuren er modificeret fra Dahl et al. 10. Denne forskning blev oprindeligt offentliggjort i Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, Salmon L, Horowitz S, Bardwell JC, Jakob U. HdeB fungerer som en syre-beskyttende chaperone i bakterier. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright American Society for Biokemi og Molekylær Biologi. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at undersøge mekanismen for aktivering og chaperone funktion af HdeB, store mængder HdeB skal udtrykkes og oprenses. Et antal ekspressionsvektorsystemer er tilgængelige til produktion af høje niveauer af et målprotein, herunder pTrc eller pBAD-vektorer, som begge blev anvendt i denne undersøgelse. Initiativtagerne er let tilgængelige for E. coli-RNA-polymerase og dermed give kraftigt opreguleret ekspression af HdeB i enhver E. coli-stamme. Dette aspekt er særligt relevant for in vivo overekspression studie af HdeB under sure stress betingelser, hvor rpoH deficiente stamme blev udnyttet. Denne stamme mangler de fleste af chaperoner og således er mere følsomme over for forskellige stressfaktorer, herunder forhøjet temperatur, lavt pH og oxidativt stress 15. Som alternativ, undersøgelser svarende til dem, der præsenteres her kan udføres i mutante stammer, der mangler genet af interesse overlevelse.
t "> Det eksperimentelle design til enhver chaperone aktivitet eller refoldning assay skal nøje overvejes, både i forhold til den type kunde, koncentrationen af kundens protein og bufferen betingelser. I typiske chaperone analyser, model klient proteiner, såsom citratsynthase, luciferase, eller malat-dehydrogenase er denatureret i høje koncentrationer af urinstof eller guanidin-HCl og fortyndet i denatureringsmiddel-fri buffer til at inducere aggregering 23,13. Målinger i nærvær af chaperoner afslører, i hvilket omfang de forhindrer proteinaggregering. Alternativt klienterne er termisk udfoldet og protein aggregation overvåges. i begge tilfælde er lysspredningsmålinger anvendes som udlæsning til proteinaggregering. Aktive chaperoner forhindre aggregering af udfoldning klient proteiner, hvilket forårsager en formindskelse i lysspredning signal 6. både af disse forsøgsopstillinger kan kombineres med lav pH inkubation. Ud over at vurdere molecular chaperonaktivitet ved at overvåge deres evne til at forhindre aggregering af bestemte klient proteiner, kan indflydelsen af chaperoner på klient refoldning ved tilbagevenden til ikke-stressbetingelser afprøves 24. Dette er især ligetil når kunden proteiner besidder enzymatisk aktivitet, der kan anvendes som kvantitativ udlæsning for deres inaktivering og genaktivering. Mens chaperone-medieret refoldning er naturligvis en ATP-afhængig proces, har periplasmatiske chaperoner såsom HdeA, HdeB og Spy blevet vist at lette klient genfoldning i en ATP-uafhængig måde i overensstemmelse med den mangel på energi i periplasmaet 9,25.Undersøgelse af pH optimum af en syre-beskyttende chaperone såsom HdeB er udfordrende på grund af forskellige årsager: (i) sammenlægning adfærd af selv veletablerede chaperone-klient proteiner, såsom citrat syntase afviger ved sur pH; og (ii) kun få puffersystemer fungerer i pH-området mellem 2-5 og er suitabel for både chaperone af interesse og kunden proteinet. Vi besluttede at bruge phosphatbuffer, selv om vi er klar over, at dette er et ikke-ideelle buffersystem under sure pH-betingelser. Imidlertid blev phosphatbuffer sig at være velegnet til at karakterisere HdeA som syreaktiveret chaperone 9,22. Sammenlægning målinger er meget følsomme over for ændringer i temperatur eller buffer indhold. For at eliminere falske positive resultater, anbefaler vi derfor altid teste indflydelsen af anstandsdame storage buffer på klient sammenlægning (figur 1, buffer kontrol). Sommetider sammenlægning af klienten protein sker så hurtigt, at selv den bedste anstandsdame ikke kunne være i stand til at konkurrere med sammenlægning processen. Det er derfor vigtigt at foretage indledende test for at finde de optimale assay betingelser. Et godt eksempel på en sådan situation er givet i vores ultracentrifugering eksperimenter, hvor inkubation af LDH ved temperaturer på> 42 ° C er så hurtigt, at selv detilstedeværelse af et overskud af HdeB forhindrer ikke LDH aggregering. Derudover chaperone / co-chaperone-forhold eller chaperone / klient-forhold skal bestemmes nøje 23. Vi begyndte at bruge en temmelig høj HdeB: MDH forhold på 50: 1 i præliminære forsøg, at hjalp os med at identificere pH 4 som den optimale pH for chaperonaktivitet af HdeB. Vi fortsatte derefter analysere HdeB: MDH-forhold mellem 1: 1 og 50: 1 ved pH 4, identificere 25: 1 for at være det mest effektive forhold. I modsætning hertil HdeA undertrykte MDH sammenlægning som 10: 1 chaperone: klient nøgletal 6,9,10,22. Konkluderer vi derfor, at HdeA, i forhold til HdeB, er mere effektive til at undertrykke MDH sammenlægning lavere chaperone: klient-forhold var tilstrækkelige til helt at undertrykke MDH sammenlægning. En anden metode til at undersøge chaperone-medieret suppression af protein aggregation involverer spin-down assays, i hvilke klient aggregater fjernes ved centrifugering og kvantificerede ved SDS PAGE. Denne tilgang er også velegnet til mILSYN indflydelse af chaperoner på protein aggregation in vivo. Mutantstammer, der enten overudtrykker eller mangel chaperonen af interesse er udsat for proteinudfoldning stressbetingelser. Efterfølgende lyseres cellerne og opløselige og aggregerede fraktioner adskilles og kvantificeres 15,16,26.
Til påvisning af klient-chaperone-kompleks, vi anvendt analytisk ultracentrifugering. Det skal her bemærkes, at baseret på forsøgsopstillingen ikke er det muligt direkte at kvantificere mængden af HdeB og LDH monomerer bundet i dette kompleks, som begge proteiner absorberer ved 280 nm. Om ønsket kan støkiometri chaperonen-klient-kompleks bestemmes ved separat mærkning chaperone og klient-protein med en chromophor, hvis excitationsmaksimum ligger inden for det synlige område. Alternativt kan støkiometrien af klienter til chaperoner inden komplekser bestemmes ved anvendelse nativ PAGE kombineret med kvantitativ western blot. Ved at følge protokollerne præsenteres her, var vi i stand til at karakterisere to molekylære chaperoner, HdeA, og HdeB 9,10,22. Generelt kan disse assays også anvendes til at undersøge rollen af potentielle inhibitorer af molekylære chaperoner i proteinrefoldning in vitro og in vivo eller kan anvendes til at teste syntetiske chaperoner for deres evne til at forhindre klient aggregering under sure stress. Desuden kan de protokoller, der præsenteres her anvendes til analyser af punktmutationer og / eller trunkerede varianter af de syreaktiveret chaperoner for at kaste lys ind i mekanismen for deres aktivering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Claudia Cremers for hendes nyttige råd om chaperone analyser. Ken Wan er anerkendt for sin tekniske bistand i HdeB rensning. Dette arbejde blev støttet af Howard Hughes Medical Institute (til JCAB) og National Institutes of Health tilskud RO1 GM102829 til JCAB og UJJ-UD understøttes af en postdoc stipendium fra den tyske Research Foundation (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEB10-beta E. coli cells | New England Biolabs | C3019I | |
| Ampicillin | Gold Biotechnology | A-301-3 | |
| LB Broth mix, Lennox | LAB Express | 3003 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C50 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Tris | Amresco | 0826-5kg | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Polymyxin B sulfate | ICN Biomedicals Inc. | 100565 | |
| 0.2 µm pore sterile Syringe Filter | Corning | 431218 | |
| HiTrap Q HP (CV 5 ml) | GE Healthcare Life Sciences | 17-1153-01 | |
| Mini-Protean TGX, 15% | Bio-Rad | 4561046 | |
| Malate dehydrogenase (MDH) | Roche | 10127914001 | |
| Potassium phosphate (Monobasic) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Potassium phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| F-4500 fluorescence spectrophotometer | Hitachi | FL25 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126-5G | |
| NADH | Sigma | N8129-100MG | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9390-2.5KG | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S397-500 | |
| Lactate dehydrogenase (LDH) | Roche | 10127230001 | |
| Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392764 | |
| Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled | Beckman Coulter | 306493 | |
| AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
| Wizard Plus Miniprep Kit | Promega | A1470 | used for plasmid purification (Protocol 5.1) |
| L-arabinose | Gold Biotechnology | A-300-500 | |
| Glycine | DOT Scientific Inc | DSG36050-1000 | |
| Fluorescence Cell cuvette | Hellma Analytics | 119004F-10-40 | |
| Oligonucleotides | Invitrogen | ||
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| dNTP set | Invitrogen | 10297018 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL | Millipore | UFC900324 | |
| Centrifuge Avanti J-26XPI | Beckman Coulter | 393127 | |
| Varian Cary 50 spectrophotometer | Agilent Tech | ||
| Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa | Spectrum Laboratories | 132650 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K | Millipore | UFC803024 | |
| SDS | Fisher Scientific | bp166-500 | |
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Thermo Fisher | 4375786 |
References
- Smith, J. L. The Role of Gastric Acid in Preventing Foodborne Disease and How Bacteria Overcome Acid Conditions. J Food Protect. 66, 1292-1303 (2003).
- Hong, W., Wu, Y. E., Fu, X., Chang, Z. Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in enteric bacteria. Trends Microbiol. 20 (7), 328-335 (2012).
- Koebnik, R., Locher, K. P., Van Gelder, P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
- Reichmann, D., Xu, Y., et al. Order out of Disorder: Working Cycle of an Intrinsically Unfolded Chaperone. Cell. 148 (5), 947-957 (2012).
- Bardwell, J. C. A., Jakob, U.
- Tapley, T. L., Korner, J. L., et al. Structural plasticity of an acid-activated chaperone allows promiscuous substrate binding. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5557-5562 (2009).
- Hong, W., Jiao, W., et al. Periplasmic Protein HdeA Exhibits Chaperone-like Activity Exclusively within Stomach pH Range by Transforming into Disordered Conformation. J Biol Chem. 280 (29), 27029-27034 (2005).
- Zhang, B. W., Brunetti, L., Brooks, C. L. III Probing pH-Dependent Dissociation of HdeA Dimers. J Am Chem Soc. 133, 19393-19398 (2011).
- Tapley, T. L., Franzmann, T. M., Chakraborty, S., Jakob, U., Bardwell, J. C. A. Protein refolding by pH-triggered chaperone binding and release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 1071-1076 (2010).
- Dahl, J. -U., Koldewey, P., Salmon, L., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. HdeB Functions as an Acid-protective Chaperone in Bacteria. J Biol Chem. 290 (1), 65-75 (2015).
- Waterman, S. R., Small, P. L. C. Identification of sigmas-dependent genes associated with the stationary-phase acid-resistance phenotype of Shigella flexneri. Mol Microbiol. 21 (5), 925-940 (1996).
- Mucacic, M., Baneyx, F. Chaperone Hsp31 Contributes to Acid Resistance in Stationary-Phase Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 73 (3), 1014-1018 (2007).
- Daugherty, D. L., Rozema, D., Hanson, P. E., Gellman, S. H. Artificial Chaperone-assisted Refolding of Citrate Synthase. J Biol Chem. 273, 33961-33971 (1998).
- Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. A. Chaperone Activity with a Redox Switch. Cell. 96 (3), 341-352 (1999).
- Guisbert, E., Yura, T., Rhodius, V. A., Gross, C. A. Convergence of Molecular, Modeling, and Systems Approaches for an Understanding of the Escherichia coli Heat Shock Response. Microbiol Mol Biol Rev. 72 (3), 545-554 (2008).
- Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Mol Microbiol. 40 (2), 397-413 (2001).
- Schuck, P. Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling. Biophys J. 78 (3), 1606-1619 (2000).
- Analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit. analyticalultracentrifugation.com. , Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm (2016).
- Sednterp. bitcwiki.sr.unh.edu. , Available from: http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page (2012).
- Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution. Methods. 95, 55-61 (2016).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harb Protoc. 2006, (2006).
- Foit, L., George, J. S., Zhang, B. inW., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A.
- Nicoll, W. S., Boshoff, A., Ludewig, M. H., Hennessy, F., Jung, M., Blatch, G. L. Approaches to the isolation and characterization of molecular chaperones. Protein Express Purif. 46, 1-15 (2006).
- Minami, Y., Hohfeld, J., Ohtsuka, K., Hartl, F. U. Regulation of the Heat-shock Protein 70 Reaction Cycle by the Mammalian DnaJ Homolog, Hsp40. J Biol Chem. 271 (32), 19617-19624 (1996).
- Quan, S., Koldewey, P. Genetic selection designed to stabilize proteins uncovers a chaperone called Spy. Nat Struct Mol Biol. 18, 262-269 (2011).
- Gray, M. J., Wholey, W. Y. Polyphosphate Is a Primordial Chaperone. Mol Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
