Een<em> In Vitro</em> Model van de bloed-hersen barrière met behulp van Impedantiespectroscopie: een focus op T-cel-endotheelcellen Interaction
Summary
Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.
Abstract
Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not naïve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.
Introduction
De bloed-hersenbarrière scheidt de systemische circulatie van het centrale zenuwstelsel (CNS) 1-3. Het voorziet in een fysieke barrière die het vrije verkeer van cellen en de verspreiding van in water oplosbare moleculen remt en beschermt de hersenen tegen pathogenen en potentieel schadelijke stoffen. Naast de barrièrefunctie de BBB maakt de overdracht van zuurstof en voedingsstoffen naar de hersenen parenchym waardoor de correcte werking van het neuronaal weefsel waarborgt. Functionele eigenschappen van de BBB wordt sterk gereguleerd door zijn cellulaire en acellulaire componenten, met zeer gespecialiseerde EC dat is haar belangrijkste structurele element. EC van de BBB wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van tight junction (TJ) complexen, het gebrek aan fenestrations, pinocytose extreem lage activiteit en permanent actieve transportmechanismen. Andere componenten van de BBB de EC basaal membraan, pericytes het inbedden van het endotheel, astrocytaire end voeten en = bijbehorende parenchymal basaalmembraan ook bijdragen aan de ontwikkeling, instandhouding en functie van de BBB 2,4 – 6 en samen met neuronen en microglia, vormen de neurovasculaire eenheid (NVU) waardoor de correcte werking van het CZS 7 maakt – 9.
In verschillende neurologische ziekten zoals neurodegeneratieve, ontstekings- of infectieziekten, is de functie van de BBB gecompromitteerde 2,5,10. Ontregeling van TJ complexen en moleculaire transportmechanismen leidt tot BBB permeabiliteit extravasatie van leukocyten, ontsteking en neuronale schade toe. Om BBB eigenschappen studeren onder dergelijke pathofysiologische omstandigheden, hebben verschillende in vitro BBB modellen vastgesteld 9,11,12. Samen hebben ze waardevolle inzichten in de veranderingen van de barrière integriteit, doorlaatbaarheid evenals transport mechanismen. Deze modellen maken gebruik endotheliale cellen van mens, muis, rat, varken of bschapen afkomst 13-18; primaire endotheliale cellen of cellijnen worden gekweekt hetzij als monocultuur of samen met pericyten en / of astrocyten om nauwer bootsen de BBB in vivo 19-25. De laatste jaren is het meten van transendotheliale elektrische weerstand (TEER) wordt een algemeen aanvaarde instrument om endotheliale barrière-eigenschappen 26,27 beoordelen.
TEER weerspiegelt de impedantie op de ionenflux over de cel monolaag en de afname verschaft een gevoelige maatstaf van gecompromitteerde endotheliale barrière integriteit en derhalve verhoogde permeabiliteit. Diverse TEER meetsystemen zijn ontwikkeld, waaronder epitheliale Voltohmmeter (EVOM), elektrische cel-substraat Impedantie Sensing (ECIS), en real-time cell analyse 15,28 – 30. TEER weerspiegelt de weerstand tegen ion flux tussen aangrenzende EC (paracellulaire route) en is recht evenredig met debarrière integriteit. In impedantie spectroscopie 27,31, is complex totale impedantie (Z) gemeten, die meer informatie over de barrière integriteit door het meten van Ccl biedt. Ccl betreft de capacitieve stroom door het celmembraan (transcellulaire route): de cellaag fungeert als een condensator in het equivalente elektrische circuit, het scheiden van de lasten aan beide zijden van het membraan en is omgekeerd evenredig met de barrière integriteit. Wanneer geteeld op doorlatende inserts, EC hechten, vermenigvuldigen en verspreid over het microporeuze membraan. Dit weerstaat de achtergrond capacitieve stroom van het inzetstuk (die zelf werkt als een condensator) en leidt tot een afname van de capaciteit tot aan de minimale niveau bereikt. Dit wordt gevolgd door de instelling van TJ complexen die afdichting van de ruimte tussen aangrenzende EC. Dit beperkt de ion flux door de paracellulaire route en TEER verhoogt tot het zijn plateau bereikt. Onder ontstekingstoestanden, maar de endothelial barrière in het gedrang komt: TEER afneemt als TJ complexen krijgen verstoord en Ccl toeneemt naarmate de capacitieve component van het inzetstuk weer stijgt.
Onze TEER meting maakt gebruik van de geautomatiseerde celbewaking 32 systeem: het volgt het principe van impedantie spectroscopie en breidt haar eerdere aanvragen. Hier beschrijven we een in vitro model BBB dat de studie van de barrière-eigenschappen, zoals de interactie van hersenen endotheel met immuuncellen mogelijk maakt; met name geactiveerde T-cellen. Zulke pathofysiologische aandoeningen zijn waargenomen bij auto-immuunziekten van het CZS, zoals multiple sclerose en diermodel experimentele autoimmune encefalomyelitis 33-37. Hier, een cruciale stap is de transmigratie van encefalitogene, myeline-specifieke T-cellen over de BBB. Dit wordt gevolgd door reactivering in de perivasculaire ruimte en het in het hersenparenchym, waar ze rekruteren andere immuuncellen en melijke ontsteking en daaropvolgende demyelinatie 1,35,38. Echter, de moleculaire mechanismen van de interactie tussen deze T-cellen en endotheelcellen, de hoofdbestanddelen van de BBB, zijn niet goed begrepen. Ons protocol is bedoeld om deze leemte op te vullen en geeft nieuwe inzichten in de gevolgen op endotheelcellen (dat wil zeggen, barrière integriteit en permeabiliteit) op hun directe contact en de complexe interactie met geactiveerde T-cellen.
De hier beschreven protocol maakt gebruik van primaire muizenhersenen microvasculaire endotheliale cellen, gekweekt als een monolaag op permeabele inserts met microporeuze membranen. Endotheelcellen samen gekweekt met CD4 + T-cellen, die vooraf worden geactiveerd hetzij polyklonaal of een antigeen-specifieke wijze. Co-cultuur van MBMECs met pre-geactiveerde, maar niet naïeve T-cellen induceert een daling van TEER en een toename van Ccl die een kwantitatieve meting van de MBMEC dysfunctie en barrièrebeschadiging verschaft. de techniekis non-invasief: het gebruikt ingebouwde plaats van eetstokje elektroden, die belangrijke verstoring van de EC monolaag te voorkomen; het kan worden gebruikt om de barrièrefunctie te controleren zonder het gebruik van celmarkers. Het maakt continue metingen op een geautomatiseerde manier en maakt een onafhankelijke beoordeling van de twee barrière parameters (TEER en Ccl) tegelijkertijd in de tijd. De werkwijze is gevoelig genoeg om onderscheid te maken tussen verschillende T cel activering en werking van dergelijke T-cellen op EC.
Het kan worden gebruikt in een breed scala aan functionele testen: verschillende cytokinen en / of chemokinen betrokken bij ontstekingsprocessen kunnen de co-cultuur van MBMECs en T-cellen worden toegevoegd; blokkerende antilichamen tegen celadhesie moleculen aan beide EG of T-cel zijde kan worden gebruikt; en inhibitoren van T-cel activatie merkers of hun cytolytische eigenschappen kunnen tijdens de T-cel priming of de co-kweek met EC's worden toegevoegd. De test is ook bruikbaar voor T-cel transmigratieassays, omdat het als een kwaliteitscontrole van de integriteit MBMEC monolaag voorafgaande aan de toevoeging van T-cellen kunnen dienen. Dit alles maakt deze methode een veelzijdig en betrouwbaar instrument om de BBB in vitro onderzoek, met een focus op het effect van geactiveerde T-cellen op monolaag integriteit EC. Dit is van bijzonder belang voor het begrijpen van de mechanismen van de BBB verstoring in de pathogenese van auto-immuunziekten, zoals MS en EAE diermodel, waarbij autoreactieve, encefalitogene T-cellen steek de BBB en ontsteking en neuronale schade.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verschillende stappen van het beschreven protocol zijn essentieel voor een geslaagd experiment. Tijdens de eerste MBMEC isolatie en kweek, is het cruciaal dat gewerkt wordt onder steriele omstandigheden zo veel mogelijk om de verontreiniging van de celkweek met schimmelsporen en bacteriën te voorkomen. Om een reincultuur van EC te verkrijgen, wordt aanbevolen een medium dat Puromycine voor de eerste drie dagen, die overleving van EC maakt, maar geen andere celtypen (met name pericyten) 41,42 gebruiken. Een a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor Annika Engbers en Frank Kurth voor hun uitstekende technische ondersteuning en Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) voor nuttige discussies over TEER metingen. Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), SFB1009 project A03 HW en LK, CRC TR128, projecteert A08; Z1 en B01 LK en HW, en het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (Medische Faculteit van Münster) subsidie nummer KL2 / 2015/14 naar LK.
Materials
| cellZscope | nanoAnalytics GmbH | www.nanoanalytics.com | including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 |
| Ultracentrifuge | Thermo Scientific | www.thermoscientific.com | SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation |
| flow cytometer | Beckman Coulter | www.beckmancoulter.com | for analysis of T cell transmigration |
| FlowJo7.6.5 software | Tree Star | www.flowjo.com | for analysis of T cell transmigration |
| Oak Ridge centrifuge tubes, PC | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 ml; for MBMEC isolation |
| Transwell membrane inserts – pore size 0.4 µm | Corning | 3470 | for TEER measurement as the main readout |
| Transwell membrane inserts – pore size 3 µm | Corning | 3472 | for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay |
| 24-well cell culture plate | Greiner | 650 180 | flat-bottom; for MBMEC culture |
| 96-well cell culture plate | Costar | 3526 | round-bottom; for immune cell culture |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns |
| Neubauer counting chamber | Marienfeld | MF-0640010 | for cell counting |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | for immune cell isolation |
| Cell strainer, 40 µm | Corning | 352340 | for immune cell isolation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for immune cell isolation |
| MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for T cell and B cell isolation |
| MACS MS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for dendritic cell isolation |
| Mouse CD4 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | for CD4+ T cell isolation |
| Mouse CD19 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-201 | for B cell isolation |
| Mouse CD11c MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | for dendritic cell isolation |
| Collagen type IV from human placenta | Sigma | C5533 | for MBMEC coating solution |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | for MBMEC coating solution |
| Collagenase 2 (CSL2) | Worthington | LS004176 | for MBMEC isolation |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche | 11097113001 | for MBMEC isolation |
| DNase I | Sigma | DN25 | for MBMEC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | for MBMEC isolation |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Amresco | 0332-100G | for MBMEC isolation |
| Percoll | Sigma | P1644-1L | for MBMEC isolation |
| DMEM (+ GlutaMAX) | Gibco | 31966-021 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | for MBMEC and immune cell isolation |
| Heparin | Sigma | H3393 | for MBMEC culture medium |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | for MBMEC culture medium |
| Puromycin | Sigma | P8833 | for MBMEC culture medium; only for the first three days |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | for harvesting MBMECs |
| Collagenase Type IA | Sigma | C9891 | for dendritic cell isolation |
| Trypan Blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| EDTA | Sigma | E5134 | for immune cell isolation |
| IMDM + 1% L-Glutamin | Gibco | 21980-032 | for T cell culture medium |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE04-418Q | protect from light; for B cell culture medium |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | for B cell culture medium |
| L-Glutamine (100x Glutamax) | Gibco | 35050-061 | for B cell culture medium |
| mouse MOG35—55 peptide | Biotrend | BP0328 | for antigen-specific T cell activation |
| purified anti-mouse CD3 Ab | BioLegend | 100302 | clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation |
| purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab | BD Pharmingen | 553294 | clone 37.51; for polyclonal T cell activation |
| Recombinant Murine IFN-γ | PeproTech | 315-05 | for T-cell transmigration assays |
| Recombinant Murine TNF-α | PeproTech | 315-01A | for T-cell transmigration assays |
| NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody | BD Biosciences | 554408 | clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml |
| Granzyme B Inhibitor II | Calbiochem | 368055 | recommended final concentration: 10 µM |
| PE anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 116005 | clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration |
Referências
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Immunopathol. 31 (4), 497-511 (2009).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
- Luissint, A. -. C., Artus, C., Glacial, F., Ganeshamoorthy, K., Couraud, P. -. O. Tight junctions at the blood brain barrier: physiological architecture and disease-associated dysregulation. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 23 (2012).
- Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
- Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Stanimirovic, D. B., Friedman, A. Pathophysiology of the neurovascular unit: disease cause or consequence?. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1207-1221 (2012).
- Hawkins, B. T., Davis, T. P. The Blood-Brain Barrier / Neurovascular Unit in Health and Disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
- Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
- Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. -. O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
- Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
- Bernas, M. J., Cardoso, F. L., et al. Establishment of primary cultures of human brain microvascular endothelial cells to provide an in vitro cellular model of the blood-brain barrier. Nat Protoc. 5 (7), 1265-1272 (2010).
- Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204 (2014).
- Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J Vis Exp. (88), (2014).
- Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), (2013).
- Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Abbott, N. J. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Res. 1521, 16-30 (2013).
- Burek, M., Salvador, E., Förster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J Vis Exp. (66), e4022 (2012).
- Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. Int J Biochem Cell Biol. 43 (9), 1284-1293 (2011).
- Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved in vitro BBB model: RBEC co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
- Sansing, H. A., Renner, N. A., MacLean, A. G. An inverted blood-brain barrier model that permits interactions between glia and inflammatory stimuli. J Neurosci Methods. 207 (1), 91-96 (2012).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
- Xue, Q., Liu, Y., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9 (2), 174-189 (2013).
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Nakagawa, S., Deli, M. A., et al. Pericytes from Brain Microvessels Strengthen the Barrier Integrity in Primary Cultures of Rat Brain Endothelial Cells. Cell Mol Neurobiol. 27 (6), 687-694 (2007).
- Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -. J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and barriers of the CNS. 10 (1), 5 (2013).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. J Vis Exp. (85), (2014).
- Kroon, J., Daniel, A. E., Hoogenboezem, M., van Buul, J. D. Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow. J Vis Exp. (90), e51766 (2014).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Galla, H. J., Thanabalasundaram, G., Wedel-Parlow, M., Rempe, R. G., Kramer, S., El-Gindi, J., Schäfer, M. A. B. The Blood-Brain-Barrier in Vitro: Regulation, Maintenance and Quantification of the Barrier Properties by Impedance Spectroscopy. Horizons in Neuroscience Research. , (2011).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The Blood-Brain Barrier, Chemokines and Multiple Sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
- Larochelle, C., Alvarez, J. I., Prat, A. How do immune cells overcome the blood-brain barrier in multiple sclerosis. FEBS Lett. 585 (23), 3770-3780 (2011).
- Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T Lymphocyte-Endothelial Cell Interactions. Annu Rev Immunol. 22 (1), 683-709 (2004).
- Lyck, R., Engelhardt, B. Going Against the Tide – How Encephalitogenic T Cells Breach the Blood-Brain Barrier. J Vasc Res. 49 (6), 497-509 (2012).
- Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm (Vienna). 113 (4), 477-485 (2006).
- von Wedel-Parlow, M., Schrot, S., Lemmen, J., Treeratanapiboon, L., Wegener, J., Galla, H. -. J. Neutrophils cross the BBB primarily on transcellular pathways: An in vitro study. Brain Res. 1367, 62-76 (2011).
- Perrière, N., Demeuse, P. H., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J Neurochem. 93 (2), 279-289 (2005).
- Bendayan, R., Lee, G., Bendayan, M. Functional expression and localization of P-glycoprotein at the blood brain barrier. Microsc Res Tech. 57, 365-380 (2002).
- Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 315-327 (2011).
- Malina, K. C. K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
- Ruck, T., Bittner, S., Meuth, S. Blood-brain barrier modeling: challenges and perspectives. Neural Regen Res. 10 (6), 889 (2015).
- Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, 162-174 (2005).
- Schrot, S., Weidenfeller, C., Schäffer, T. E., Robenek, H., Galla, H. -. J. Influence of hydrocortisone on the mechanical properties of the cerebral endothelium in vitro. Biophys J. 89 (6), 3904-3910 (2005).
- Seebach, J., Dieterich, P., et al. Endothelial barrier function under laminar fluid shear stress. Lab Invest. 80 (12), 1819-1831 (2000).
- Siddharthan, V., Kim, Y. V., Liu, S., Kim, K. S. Human astrocytes/astrocyte-conditioned medium and shear stress enhance the barrier properties of human brain microvascular endothelial cells. Brain Res. 1147, 39-50 (2007).
- Santaguida, S., Janigro, D., Hossain, M., Oby, E., Rapp, E., Cucullo, L. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784 (2012).
- Griep, L. M., Wolbers, F., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
