<em> במבחנה</em> דגם של מחסום דם-מוח באמצעות ספקטרוסקופיית עכבה: התמקדות T Cell-אנדותל אינטראקציה תא

Summary

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Abstract

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not naïve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

Introduction

מחסום דם-המוח מפריד בין המחזור המערכתי ממערכת העצבים המרכזית (CNS) ^{1 – 3.} הוא מספק מכשול פיזי מעכב את התנועה החופשית של תאים ואת דיפוזיה של מולקולות מסיסות במים מגן על המוח מפני פתוגנים ואפשרות חומרים מזיקים. בנוסף תפקוד המחסום שלה, BBB מאפשרת אספקה ​​של חמצן וחומרים מזינים את המוח parenchyma, אשר מבטיח תפקוד תקין של רקמות עצביות. תכונות פעילות של BBB מוסדרות מאוד על ידי המרכיבים התאיים ו acellular שלה, עם ECS מאוד מיוחדת להיות האלמנט המבני העיקרי שלה. ECS של BBB מאופיינת על ידי הנוכחות של צומת חזק (TJ) מתחמים, חוסר fenestrations, פעילות pinocytic נמוכה מאוד, ואת מנגנוני הובלה פעילים באופן קבוע. רכיבים אחרים של BBB קרום המרתף EC, pericytes הטבעה האנדותל, הרגליים בסוף astrocytic ו = נקוב הקשוריםקרום במרתף enchymal גם לתרום לפיתוח, תחזוקה ותפקוד של BBB ^{2,4 – 6,} ויחד עם נוירונים microglia, מהווים את יחידת העצבים וכלי הדם (NVU), המאפשר תפקוד תקין של מערכת העצבים המרכזית ^{7 – 9.}

במגוון מחלות נוירולוגיות, כגון ניווניות, מחלות דלקתיות או זיהומיות, הפונקציה של BBB נפגעת ^2,5,10. חוסר וויסות של TJ מתחמי מנגנוני הובלה מולקולרי מוביל גדל חדירות BBB, extravasation לויקוציטים, דלקת ופגיעה עצבית. על מנת ללמוד נכסים BBB בתנאים pathophysiological כאלה, שונים במבחנה מודלים BBB הוקמו ^9,11,12. יחד הם סיפקו תובנות רבות ערך את השינויים של מחסום שלמות, חדירות וכן מנגנוני הובלה. מודלים אלה מעסיקים תאי אנדותל של אדם, עכבר, חולדה, חזירי או בהמוצא כבש ^{13 – 18;} תאי אנדותל ראשוני או שורות תאים בתרבית או כמו monoculture או יחד עם pericytes ו / או האסטרוציטים כדי לחקות באופן הדוק יותר את BBB in vivo ^{19 – 25.} בשנים האחרונות, מדידת ההתנגדות החשמלית Transendothelial (TEER) הפכה לכלי מקובל להעריך נכסי מכשול אנדותל ^26,27.

TEER משקף את עכבת שטף היונים על פני בשכבת תא הירידה שלה מספקת מדד רגיש של שלמות מחסום אנדותל שנפרץ ומכאן חדירות מוגברת. מערכות המדידה TEER שונים פותחו, כולל אפיתל Voltohmmeter (EVOM), חישה עכבה Cell-המצע חשמלי (ECIS), וניתוח התא בזמן אמת ^{15,28 – 30.} TEER משקף את התנגדות שטף היון בין ECS הסמוכים (מסלול paracellular) והוא ביחס ישרמחסום שלמות. הספקטרוסקופיה עכבת ^27,31, עכבה הכוללת מורכבת (Z) נמדדה, אשר מספקת מידע נוסף על שלמות המחסום ידי מדידת Ccl. Ccl מתייחס נוכחי קיבולי דרך קרום תא (מסלול transcellular): שכבת התאים מתנהגת כמו קבלים במעגל השווה החשמלי, הפרדת האישומים משני צידי הממברנה ואת עומדת ביחס הפוך על שלמות המכשול. כאשר גדל על מוסיף חדיר, ECS לדבוק, להתרבות על פני קרום microporous. זה מתנגד זרם קיבולי הרקע של הכנס (שבעצמו מתנהג כמו קבלים) ומוביל לירידת הקיבול עד שהוא מגיע לרמה המינימאלית שלה. זה ואחריו הקמת TJ מתחמים כי חותם מן החלל בין ECS הסמוך. זה מגביל את שטף היון דרך מסלול paracellular, ו TEER מגדילה עד שהוא מגיע לרמה שלה. בתנאים דלקתיים, אולם endotheliמחסום אל נפגע: TEER יורדת ככל TJ קומפלקסים לקבל שיבש Ccl מתחזקת ככל רכיב הקיבולים של הכנס עולה שוב.

מדידת TEER שלנו עושה שימוש במערכת תא ניטור ³² אוטומטית: מסקנה היא עיקרון ספקטרוסקופיה עכבה ומרחיב הבקשות הקודמות שלה. כאן אנו מתארים מודל BBB במבחנה המאפשר חקר תכונותיהם המחסום, כולל האינטראקציה של האנדותל מוח עם תאי חיסון; בפרט תאי T מופעלים. תנאי pathophysiological כאלה הם נצפו מחלות אוטואימוניות של מערכת העצבים המרכזית, כגון טרשת נפוצה ודלקת encephalomyelitis אוטואימוניות הניסוי במודל חיה שלה ^{33 – 37.} כאן, צעד חיוני הוא הגלגול של encephalitogenic, תאי T ספציפי-המיאלין ברחבי BBB. זה ואחריו מחדש שלהם במרחב perivascular וכניסת parenchyma המוח, שם הם מגייסים תאי חיסון אחרים ואותידלקת diate ו demyelination עוקבת ^1,35,38. עם זאת, מנגנונים מולקולריים של האינטראקציה בין תאי T כגון ותאי האנדותל, המרכיבים העיקריים של BBB, אינם מובנים היטב. הפרוטוקול שלנו שואף למלא את הפער הזה ולתת תובנה חדשות על ההשלכות על תאי האנדותל (כלומר, שלמות מחסום וחדירות) במגע הישיר שלהם גומלין מורכב עם תאי T מופעלים.

הפרוטוקול המתואר כאן עושה שימוש בתאי אנדותל כלי הדם במוח העכבר העיקרי, גדל כמו בשכבה על מוסיף חדיר עם ממברנות microporous. תאי האנדותל הם שיתוף תרבותי עם תאי CD4 ⁺ T, אשר ניתן המופעל מראש או polyclonally או בצורה אנטיגן ספציפי. עמית תרבות MBMECs עם המופעל מראש, אבל לא נאיבי בתאי T גורם לירידה TEER וגידול Ccl, אשר מספק מדד כמותי של הפרעה בתפקוד מחסום MBMEC. הטכניקהפולשני הוא: היא משתמשת מובנהית במקום אלקטרודות מקל, אשר למנוע הפרעה עיקרית של monolayer EC; ניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר תפקוד מחסום ללא שימוש סמני תא. זה גורם מדידה רציפה באופן אוטומטי ומאפשר הערכה עצמאית של שני פרמטרים מחסומים (TEER ו CCL) בו זמנית לאורך זמן. השיטה היא גם רגיש מספיק כדי להבחין בין רמות שונות של הפעלת תא T ואפקטים של תאי T כזה על ECS.

ניתן להשתמש בו במגוון רחב של מבחנים תפקודיים: ציטוקינים שונים ו / או כמוקינים מעורבים בתהליכים דלקתיים ניתן להוסיף גם את התרבות המשותפת של MBMECs ותאי T; נוגדנים חוסמים נגד מולקולות הידבקות התא משני האיחוד האירופי או בצד T-cell יכול לשמש; ומעכבים של סמנים הפעלה תא T או נכסי cytolytic שלהם ניתן להוסיף במהלך יחול תאי T או שיתוף התרבות שלהם עם ECS. Assay הוא שימושי גם עבור גלגול T-cellמבחנים, כפי שהוא יכול לשמש בקרת איכות של שלמות monolayer MBMEC לפני התוספת של תאי T. כל זה הופך שיטה זו כלי תכליתי ואמין ללמוד את BBB במבחנה, תוך שימת דגש על ההשפעה של תאי T מופעלים על שלמות monolayer EC. זה הוא בעל חשיבות מיוחדת להבנת המנגנונים של שיבוש BBB בפתוגנזה של מחלות אוטואימוניות, כגון טרשת נפוצה במודל חיה שלה EAE, שבו תגובתי עצמית, תאי T encephalitogenic לחצות את BBB ולגרום דלקת ונזק עצבי.

Protocol

עבור כל הניסויים, עכברים גדלו ומתוחזק בתנאים הפתוגן ללא ספציפיים במתקן החיה המרכזי באונ' מינסטר, על פי הנחיות גרמניות לטיפול בבעלי חיים. כל הניסויים בוצעו על פי הנחיות ועדת האתיקה ניסיון בעלי החיים ואושר על ידי הרשויות המקומיות של נורדריין-וסטפאליה, גרמניה (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217). </p…

Representative Results

איור 1 מספק סקירה כללית של המודל במבחנה BBB לשמש כדי לחקור את האינטראקציה בין תאי T ותאי האנדותל. הניסוי מורכב משלושה שלבים עיקריים. הצעד הראשון הוא הבדידות של MBMECs ראשית ממנהל בקורטקס המוח, ותרבותם במשך חמישה ימים. כשהם מגיעים למפגש בצלחת…

Discussion

כמה שלבים של הפרוטוקול המתואר חיוניים עבור ניסוי מוצלח. במהלך הבידוד MBMEC הראשונית ותרבות, חשוב כי העבודה נעשית בתנאים סטריליים ככל האפשר, כדי למנוע את הזיהום של תרבית תאים עם נבגי פטריות או חיידקים. על מנת לקבל תרבות טהורה של ECS, מומלץ להשתמש במצע המכיל puromycin עבור שלושת…

Materials

cellZscope	nanoAnalytics GmbH	www.nanoanalytics.com	including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2
Ultracentrifuge	Thermo Scientific	www.thermoscientific.com	SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation
flow cytometer	Beckman Coulter	www.beckmancoulter.com	for analysis of T cell transmigration
FlowJo7.6.5 software	Tree Star	www.flowjo.com	for analysis of T cell transmigration
Oak Ridge centrifuge tubes, PC	Thermo Fisher Scientific	3118-0050	50 ml; for MBMEC isolation
Transwell membrane inserts – pore size 0.4 µm	Corning	3470	for TEER measurement as the main readout
Transwell membrane inserts – pore size 3 µm	Corning	3472	for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay
24-well cell culture plate	Greiner	650 180	flat-bottom; for MBMEC culture
96-well cell culture plate	Costar	3526	round-bottom; for immune cell culture
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976	for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-109	for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns
Neubauer counting chamber	Marienfeld	MF-0640010	for cell counting
Cell strainer, 70 µm	Corning	352350	for immune cell isolation
Cell strainer, 40 µm	Corning	352340	for immune cell isolation
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	for immune cell isolation
MACS LS separation columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	for T cell and B cell isolation
MACS MS separation columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	for dendritic cell isolation
Mouse CD4 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-049-201	for CD4+ T cell isolation
Mouse CD19 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-052-201	for B cell isolation
Mouse CD11c MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-052-001	for dendritic cell isolation
Collagen type IV from human placenta	Sigma	C5533	for MBMEC coating solution
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141-5MG	for MBMEC coating solution
Collagenase 2 (CSL2)	Worthington	LS004176	for MBMEC isolation
Collagenase/Dispase (C/D)	Roche	11097113001	for MBMEC isolation
DNase I	Sigma	DN25	for MBMEC isolation
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F7524	for MBMEC isolation
Bovine Serum Albumin (BSA)	Amresco	0332-100G	for MBMEC isolation
Percoll	Sigma	P1644-1L	for MBMEC isolation
DMEM (+ GlutaMAX)	Gibco	31966-021	for MBMEC isolation and MBMEC culture medium
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333	for MBMEC isolation and MBMEC culture medium
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Sigma	D8537	for MBMEC and immune cell isolation
Heparin	Sigma	H3393	for MBMEC culture medium
Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	PeproTech	100-18B	for MBMEC culture medium
Puromycin	Sigma	P8833	for MBMEC culture medium; only for the first three days
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	for harvesting MBMECs
Collagenase Type IA	Sigma	C9891	for dendritic cell isolation
Trypan Blue solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	for cell counting
EDTA	Sigma	E5134	for immune cell isolation
IMDM + 1% L-Glutamin	Gibco	21980-032	for T cell culture medium
X-VIVO 15	Lonza	BE04-418Q	protect from light; for B cell culture medium
β-mercaptoethanol	Gibco	31350-010	for B cell culture medium
L-Glutamine (100x Glutamax)	Gibco	35050-061	for B cell culture medium
mouse MOG35—55 peptide	Biotrend	BP0328	for antigen-specific T cell activation
purified anti-mouse CD3 Ab	BioLegend	100302	clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation
purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab	BD Pharmingen	553294	clone 37.51; for polyclonal T cell activation
Recombinant Murine IFN-γ	PeproTech	315-05	for T-cell transmigration assays
Recombinant Murine TNF-α	PeproTech	315-01A	for T-cell transmigration assays
NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody	BD Biosciences	554408	clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml
Granzyme B Inhibitor II	Calbiochem	368055	recommended final concentration: 10 µM
PE anti-mouse CD4 antibody	Biolegend	116005	clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration